JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Génétique

In vivo funksjonell studie av sykdom-Associated sjeldne Human varianter bruke Drosophila

Published: August 20, 2019
doi:
10.3791/59658
, , , ,
1Department of Molecular and Human Genetics,Baylor College of Medicine, 2Program in Developmental Biology,Baylor College of Medicine, 3Department of Pediatrics, Section of Neurology and Developmental Neuroscience,Baylor College of Medicine, 4Jan and Dan Duncan Neurological Research Institute,Texas Children’s Hospital, 5Department of Neuroscience,Baylor College of Medicine

Summary

Målet med denne protokollen er å skissere design og ytelse av in vivo eksperimenter i Drosophila melanogaster å vurdere funksjonelle konsekvenser av sjeldne gen varianter knyttet til menneskelige sykdommer.

Abstract

Fremskritt i sekvensering teknologi har gjort hele-Genova og hel-exome datasett mer tilgjengelig for både klinisk diagnose og banebrytende menneskelig genetikk forskning. Selv om en rekke i silisiummangan algoritmer er utviklet for å forutsi patogenitet av variantene identifisert i disse datasettene, er funksjons studier avgjørende for å avgjøre hvordan spesifikke genomisk varianter påvirker protein funksjonen, spesielt for missense Varianter. I udiagnostisert sykdommer Network (UDN) og andre sjeldne sykdom forskning konsortier, modell organismer (MO) inkludert Drosophila, C. elegans, sebrafisk, og mus er aktivt brukes til å vurdere funksjonen av antatte menneskelig sykdom-forårsaker Varianter. Denne protokollen beskriver en metode for funksjonell vurdering av sjeldne menneskelige varianter som brukes i modellen organismer screening Center Drosophila kjernen i UDN. Arbeidsflyten begynner med å samle menneskelig og MO informasjon fra flere offentlige databaser, ved hjelp av MARRVEL webressurs for å vurdere om varianten er sannsynlig å bidra til pasientens tilstand, samt design effektive eksperimenter basert på tilgjengelige kunnskap og ressurser. Neste, genetiske verktøy (f. eks, T2A-GAL4 og UAS-Human cDNA linjer) er generert for å vurdere funksjonene til varianter av interesse i Drosophila. Ved utvikling av disse reagensene, kan to-kanter funksjonelle analyser basert på redning og overuttrykte eksperimenter utføres for å vurdere variant funksjon. I rednings grenen, den endogene fly gener er “humanisert” ved å erstatte orthologous Drosophila genet med referanse eller variant menneskelig transgenes. I overuttrykte grenen er referanse og variant humane proteiner exogenously drevet i en rekke vev. I begge tilfeller kan enhver scorable fenotype (f. eks, dødelighet, øye morfologi, elektrofysiologi) brukes som en lese-ut, uavhengig av sykdom av interesse. Forskjeller observert mellom referanse og variant alleler foreslå en variant-spesifikk effekt, og dermed sannsynlig patogenitet. Denne protokollen tillater raske, in vivo vurderinger av antatte menneskelige sykdom-forårsaker varianter av gener med kjente og ukjente funksjoner.

Introduction

Pasienter med sjeldne sykdommer ofte gjennomgår en krevende reise referert til som “diagnostiske Odyssey” for å få en nøyaktig diagnose1. De fleste sjeldne sykdommer antas å ha en sterk genetisk opprinnelse, noe som gjør genetisk/genomisk analyser kritiske elementer av klinisk workup. I tillegg til kandidat gen panel sekvensering og kopiere nummer variasjon analyse basert på kromosom Microarrays, hel-exome (WES) og hele-Genova sekvensering (WGS) teknologier har blitt stadig mer verdifulle verktøy i løpet av det siste tiåret2, 3i denne. For tiden er diagnostisk rate for å identifisere en kjent sykdomsfremkallende variant i Wes og WGS er ~ 25% (høyere i pediatric tilfeller)4,5. For de fleste tilfeller som forblir udiagnostisert etter klinisk WES/WGS, er et vanlig problem at det er mange kandidat gener og varianter. Neste generasjons sekvensering identifiserer ofte romanen eller Ultra-sjeldne varianter i mange gener, og tolke om disse variantene bidra til sykdom fenotyper er utfordrende. For eksempel, selv om de fleste tull eller frameshift mutasjoner i gener antas å være tap-of-Function (LOF) alleler på grunn av tull-mediert forfall av kodet transkripsjon, å avkorte mutasjoner funnet i den siste exoner unnslippe denne prosessen og kan fungere som godartet eller gevinst-av-funksjon (GOF) alleler6.

Videre er det å forutsi virkningene av en missense allel en skremmende oppgave, siden det kan resultere i en rekke forskjellige genetiske scenarioer som først beskrevet av Herman Muller på 1930-tallet (dvs. amorph, hypomorph, hypermorph, antimorph, neomorph eller isomorph)7 . Tallrike i silisiummangan programmer og metoder er utviklet for å forutsi patogenitet av missense varianter basert på evolusjonære bevaring, type aminosyre endring, posisjon innenfor et funksjonelt domene, allel frekvens i den generelle befolkningen, og andre parametre8. Men disse programmene er ikke en omfattende løsning for å løse det kompliserte problemet med variant tolkning. Interessant, en fersk studie viste at fem bredt brukt variant patogenitet prediksjon algoritmer (Polyphen9, sile10, CADD11, PROVEAN12, mutasjon forsmak) enige om patogenitet ~ 80% av tiden8 . Spesielt, selv når alle algoritmer er enige, returnerer de en feil prediksjon av patogenitet opp til 11% av tiden. Dette ikke bare fører til feil klinisk tolkning, men også kan fraråde forskere fra å følge opp nye varianter av feilaktig liste dem som godartet. En måte å utfylle den nåværende begrensningen av i silisiummangan modellering er å gi eksperimentelle data som demonstrerer effekten av varianten funksjon in vitro, ex vivo (f. eks, kulturperler celler, organoids), eller in vivo.

I vivo funksjonelle studier av sjelden sykdom assosierte varianter i MO har unike styrke13 og har blitt vedtatt av mange sjeldne sykdoms forskning initiativer rundt om i verden, inkludert udiagnostisert sykdommer Network (UDN) i USA og sjeldne Sykdommer modeller & mekanismer (RDMM) nettverk i Canada, Japan, Europa og Australia14. I tillegg til disse koordinerte tiltakene for å integrere MO-forskere i arbeidsflyten av sjeldne sykdoms diagnoser og mekanistisk studier i nasjonal målestokk, har en rekke individuelle samarbeids studier mellom kliniske og MO-forskere ført til oppdagelsen og karakterisering av mange nye menneskelig sykdom-forårsaker gener og varianter82,83,84.

I UDN, en sentralisert modell organismer screening Center (MOSC) mottar innleveringer av kandidat gener og varianter med en beskrivelse av pasientens tilstand og vurderer om varianten er sannsynlig å være patogene ved hjelp av informatikk verktøy og in vivo Eksperimenter. I fase i (2015-2018) av UDN, MOSC består av en Drosophila Core [Baylor College of MEDICINE (bcm)] og sebrafisk Core (University of Oregon) som jobbet sammen for å vurdere tilfeller. Ved hjelp av informatikk analyse og en rekke ulike eksperimentelle strategier i Drosophila og sebrafisk, har MOSC så langt bidratt til diagnostisering av 132 pasienter, identifisering av 31 nye syndromer55, oppdagelsen av flere nye menneskelige sykdoms gener (f. eks EBF315, ATP5F1D16, TBX217, IRF2BPL18, COG419, WDR3720) og fenotypiske utvidelse av kjent sykdom gener (f.eks. CACNA1A21, ACOX122).

I tillegg til prosjekter innenfor UDN, har MOSC Drosophila kjerne forskere bidratt til nye sykdoms gen funn i samarbeid med Centers for mendelsk Genomics og andre initiativer (f. eks ANKLE223, TM2D3 24, NRD125, OGDHL25, ATAD3A26, ARIH127, MARK328, DNMBP29) med samme sett av informatikk og genetisk strategier utviklet for UDN. Gitt betydningen av MO studier på sjelden sykdom diagnose, MOSC ble utvidet til å omfatte en C. elegans Core og andre sebrafisk kjerne (begge ved Washington University i St. Louis) for fase II (2018-2022) av UDN.

Dette manuskriptet beskriver en in vivo funksjonell studie protokoll som brukes aktivt i UDN MOSC Drosophila Core for å avgjøre om missense varianter har funksjonelle konsekvenser for protein av interesse ved hjelp av transgene fluer som uttrykker menneskelig Proteiner. Målet med denne protokollen er å hjelpe MO forskere samarbeider med kliniske forskningsgrupper for å gi eksperimentelle bevis på at en kandidat variant i et gen av interesse har funksjonelle konsekvenser, og dermed tilrettelegge klinisk diagnose. Denne protokollen er mest nyttig i et scenario der en Drosophila forsker er nærmet av en klinisk etterforsker som har en sjelden sykdom pasient med en bestemt kandidat variant i et gen av interesse.

Denne protokollen kan brytes ned i tre elementer: (1) samle informasjon for å vurdere sannsynligheten for den varianten av interesse å være ansvarlig for pasienten fenotype og muligheten for en funksjonell studie i Drosophila, (2) samle eksisterende genetiske verktøy og etablere nye, og (3) utfører funksjonelle studier in vivo. Det tredje elementet kan videre deles inn i to underelementer basert på hvordan funksjonen til en variant av interesse kan vurderes (redning eksperiment eller overuttrykte strategier). Det er viktig å merke seg at denne protokollen kan tilpasses og optimaliseres til mange scenarier utenfor sjeldne monogenic sykdom forskning (for eksempel vanlige sykdommer, gen-miljø interaksjoner, og farmakologiske/genetiske skjermer for å identifisere terapeutiske mål). Evnen til å bestemme funksjonaliteten og patogenitet av variantene vil ikke bare gagne pasienten av interesse ved å gi nøyaktig molekylær diagnose, men vil også ha bredere virkninger på både translational og grunnleggende vitenskapelig forskning.

Protocol

1. Gathering Human og MO informasjon å vurdere: sannsynligheten for en variant av interesse å være ansvarlig for sykdom fenotyper og gjennomførbarhet av funksjonelle studier i Drosophila Utføre omfattende database og litteratursøk for å finne ut om de spesifikke gener og varianter av interesse er gode kandidater til å forklare fenotype av pasienten av interesse. Nærmere bestemt, samle følgende informasjon. Vurdere om genet av interesse har vært tidligere innblandet…

Representative Results

Funksjonell studie av de Novo missense variant i EBF3 knyttet til neurodevelopmental fenotyperI en 7 år gammel mann med neurodevelopmental fenotyper inkludert hypotoni, ataksi, global utviklingsmessige forsinkelse, og uttrykksfulle tale uorden, leger og menneskelig Genetikere ved National Institutes of Health udiagnostisert sykdommer Project (UDP) identifiserte en de Novo missense variant (p. R163Q) i EBF3 (tidlig b-Cell faktor 3)15, et gen som kode…

Discussion

Eksperimentelle studier med Drosophila melanogaster gir en robust analysen system for å vurdere konsekvensene av sykdom-assosiert menneskelige varianter. Dette er på grunn av den store kroppen av kunnskap og diverse genetiske verktøy som har blitt generert av mange forskere i fly feltet over det siste århundret89. Akkurat som alle andre eksperimentelle system, men det er viktig å erkjenne de begrensninger og begrensninger som finnes.

Advarsler knyt…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker Jose Salazar, Julia Wang, og Dr. Karen Schulze for kritisk lesning av manuskriptet. Vi erkjenner DRS. ning Liu og XI Luo for funksjonell karakterisering av TBX2 varianter diskutert her. Udiagnostisert sykdommer nettverk modell organismer screening Center ble støttet gjennom National Institutes of Health (NIH) Common Fund (U54 NS093793). H. T. C. ble videre støttet av NIH [CNCDP-k12 og NINDS (1K12 NS098482)], American Academy of nevrologi (nevrovitenskap Research Grant), Burroughs Wellcome Fund (Career Award for medisinske forskere), Child Nevrologi Society og Child Nevrologi Foundation ( Elterman stipend), og NIH Director ‘ s Early Independence Award (DP5 OD026426). M. F. W. ble ytterligere støttet av Simons Foundation (SFARI Award: 368479). S. Y. ble videre støttet av NIH (R01 DC014932), Simons Foundation (SFARI Award: 368479), Alzheimer ‘ s Association (ny etterforsker Research Grant: 15-364099), naman Family Fund for Basic Research, og Caroline Wiess Law Fund for Research i Molekylær medisin. Konfokalmikroskopi mikroskopi på BCM støttes delvis av NIH Grant U54HD083092 til Intellectual og utviklingsmessige funksjonshemminger Research Center (IDDRC) Neurovisualization Core.

Materials

Drosophila Stocks for UAS-human cDNA transgenesis
Injection strains for transgenesis (D. melanogaster) BDSC #24871 Specific Reagent: VK33 (3rd chromosome) Injection line
Injection strains for transgenesis (D. melanogaster) BDSC #24872 Specific Reagent: VK37 (2nd chromosome) Injection line
Plasmid DNA
Cloning vector Thermo Fisher #12536-017 Specific Reagent: pDONR221
Drosophila transgenesis vector Gift from Drs. Johannes Bischof and Konrad Basler (Bischof et al., 2013 PNAS) Specific Reagent: pGW-HA.attB
Molecular biology kits and reagents
Agarose Sigma-Aldrich #A2790 Specific Reagent: Agarose (molecular biology grade)
Chemically Competent Cells (E. coli) Thermo Fisher #18265017 Specific Reagent: DH5α
DNA Gel Extraction kit Thermo Fisher #K210012 Specific Reagent: PureLink Gel Extraction Kit
DNA Isolation and purification kit Qiagen #27104 Specific Reagent: QIAprep Spin Miniprep Kit
High Fidelity Polymerase NEB #M0491 Specific Reagent: Q5 Polymerase kit
Recombinase mediated cloning system Thermo Fisher #11789020 Specific Reagent: Gateway BP Clonase kit
Recombinase mediated cloning system Thermo Fisher #11791100 Specific Reagent: Gateway LR Clonase II Enzyme kit
Site Directed Mutagenesis kit Agilent #200523 Specific Reagent: Quick Change II Mutagenesis kit
Electroretinogram Rig related equipment
ERG Analysis Molecular Devices N/A Specific Reagent: Axon pCLAMP 10 Data Software Package
ERG Data Collection LabX #R150358 Specific Reagent: ISO-DAM Isolated Biologic Amplifier
ERG Stimulator Astro-Med #S48 Specific Reagent: Square Pulse Stimulator
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boycott, K. M., et al. International Cooperation to Enable the Diagnosis of All Rare Genetic Diseases. The American Journal of Human Genetics. 100 (5), 695-705 (2017).
  2. Lupski, J. R., et al. Whole-Genome Sequencing in a Patient with Charcot-Marie-Tooth Neuropathy. New England Journal of Medicine. 362 (13), 1181-1191 (2010).
  3. Boycott, K. M., Vanstone, M. R., Bulman, D. E., MacKenzie, A. E. Rare-disease genetics in the era of next-generation sequencing: discovery to translation. Nature Reviews Genetics. 14 (10), 681-691 (2013).
  4. Yang, Y., et al. Molecular Findings Among Patients Referred for Clinical Whole-Exome Sequencing. JAMA. 312 (18), 1870 (2014).
  5. Lee, H., et al. Clinical Exome Sequencing for Genetic Identification of Rare Mendelian Disorders. JAMA. 312 (18), 1880 (2014).
  6. Coban-Akdemir, Z., et al. Identifying Genes Whose Mutant Transcripts Cause Dominant Disease Traits by Potential Gain-of-Function Alleles. The American Journal of Human Genetics. 103 (2), 171-187 (2018).
  7. Muller, H. J. Further studies on the nature and causes of gene mutations. Proceedings of the Sixth International Congress of Genetics. , 213-255 (1932).
  8. Ghosh, R., Oak, N., Plon, S. E. Evaluation of in silico algorithms for use with ACMG/AMP clinical variant interpretation guidelines. Genome Biology. 18 (1), 225 (2017).
  9. Adzhubei, I. A., et al. A method and server for predicting damaging missense mutations. Nature Methods. 7 (4), 248-249 (2010).
  10. Vaser, R., Adusumalli, S., Leng, S. N., Sikic, M., Ng, P. C. SIFT missense predictions for genomes. Nature Protocols. 11 (1), 1-9 (2016).
  11. Rentzsch, P., Witten, D., Cooper, G. M., Shendure, J. l., Kircher, M. CADD: predicting the deleteriousness of variants throughout the human genome. Nucleic Acids Research. , (2018).
  12. Choi, Y., Sims, G. E., Murphy, S., Miller, J. R., Chan, A. P. Predicting the functional effect of amino acid substitutions and indels. PloS ONE. 7 (10), 46688 (2012).
  13. Wangler, M. F., et al. Model Organisms Facilitate Rare Disease Diagnosis and Therapeutic Research. Génétique. 207 (1), 9-27 (2017).
  14. Oriel, C., Lasko, P. Recent Developments in Using Drosophila as a Model for Human Genetic Disease. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 2041 (2018).
  15. Chao, H. T., et al. A Syndromic Neurodevelopmental Disorder Caused by De Novo Variants in EBF3. American Journal of Human Genetics. 100 (1), 128-137 (2017).
  16. Oláhová, M., et al. Biallelic Mutations in ATP5F1D, which Encodes a Subunit of ATP Synthase, Cause a Metabolic Disorder. American Journal of Human Genetics. 102 (3), 494-504 (2018).
  17. Liu, N., et al. Functional variants in TBX2 are associated with a syndromic cardiovascular and skeletal developmental disorder. Human Molecular Genetics. 27 (14), 2454-2465 (2018).
  18. Marcogliese, P. C., et al. IRF2BPL Is Associated with Neurological Phenotypes. American Journal of Human Genetics. 103 (2), 245-260 (2018).
  19. Ferreira, C. R., et al. A Recurrent De Novo Heterozygous COG4 Substitution Leads to Saul-Wilson Syndrome, Disrupted Vesicular Trafficking, and Altered Proteoglycan Glycosylation. The American Journal of Human Genetics. 103 (4), 553-567 (2018).
  20. Kanca, O., et al. De novo variants in WDR37 are associated with epilepsy, colobomas and cerebellar hypoplasia. Americal Journal of Human Genetics. , (2019).
  21. Luo, X., et al. Clinically severe CACNA1A alleles affect synaptic function and neurodegeneration differentially. PLOS Genetics. 13 (7), 1006905 (2017).
  22. Chung, H., et al. ACOX1 induces autoimmunity whereas a de novo gain of function variant induces elevated ROS and glial loss in humans and flies. Cell Metabolism. , (2019).
  23. Yamamoto, S., et al. A Drosophila Genetic Resource of Mutants to Study Mechanisms Underlying Human Genetic Diseases. Cell. 159 (1), 200-214 (2014).
  24. Jakobsdottir, J., et al. Rare Functional Variant in TM2D3 is Associated with Late-Onset Alzheimer’s Disease. PLoS Genetics. 12 (10), 1006327 (2016).
  25. Yoon, W. H., et al. Loss of Nardilysin, a Mitochondrial Co-chaperone for α-Ketoglutarate Dehydrogenase, Promotes mTORC1 Activation and Neurodegeneration. Neuron. 93 (1), 115-131 (2017).
  26. Harel, T., et al. Recurrent De Novo and Biallelic Variation of ATAD3A, Encoding a Mitochondrial Membrane Protein, Results in Distinct Neurological Syndromes. American Journal of Human Genetics. 99 (4), 831-845 (2016).
  27. Tan, K. L., et al. Ari-1 Regulates Myonuclear Organization Together with Parkin and Is Associated with Aortic Aneurysms. Developmental Cell. 45 (2), 226-244 (2018).
  28. Ansar, M., et al. Visual impairment and progressive phthisis bulbi caused by recessive pathogenic variant in MARK3. Human Molecular Genetics. 27 (15), 2703-2711 (2018).
  29. Ansar, M., et al. Bi-allelic Loss-of-Function Variants in DNMBP Cause Infantile Cataracts. The American Journal of Human Genetics. 103 (4), 568-578 (2018).
  30. Wang, J., et al. MARRVEL: Integration of Human and Model Organism Genetic Resources to Facilitate Functional Annotation of the Human Genome. The American Journal of Human Genetics. 100 (6), 843-853 (2017).
  31. Wang, J., Liu, Z., Bellen, H., Yamamoto, S. MARRVEL, a web-based tool that integrates human and model organism genomics information. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
  32. Mungall, C. J., et al. The Monarch Initiative: an integrative data and analytic platform connecting phenotypes to genotypes across species. Nucleic Acids Research. 45, 712-722 (2017).
  33. Hu, Y., Comjean, A., Mohr, S. E., Perrimon, N., Perrimon, N. Gene2Function: An Integrated Online Resource for Gene Function Discovery. Genes|Genomes|Genetics. 7 (8), 2855-2858 (2017).
  34. Ioannidis, N. M., et al. An Ensemble Method for Predicting the Pathogenicity of Rare Missense Variants. The American Journal of Human Genetics. 99 (4), 877-885 (2016).
  35. Szklarczyk, D., et al. The STRING database in 2017: quality-controlled protein–protein association networks, made broadly accessible. Nucleic Acids Research. 45 (1), 362-368 (2017).
  36. Hu, Y., et al. Molecular Interaction Search Tool (MIST): an integrated resource for mining gene and protein interaction data. Nucleic Acids Research. 46 (1), 567-574 (2018).
  37. Lawson, C. L., et al. EMDataBank unified data resource for 3DEM. Nucleic Acids Research. 44 (1), 396-403 (2016).
  38. Bienert, S., et al. The SWISS-MODEL Repository-new features and functionality. Nucleic Acids Research. 45 (1), 313-319 (2017).
  39. Webb, B., Sali, A. Comparative Protein Structure Modeling Using MODELLER. Current Protocols in Bioinformatics. 54, 1-37 (2016).
  40. Kelley, L. A., Mezulis, S., Yates, C. M., Wass, M. N., Sternberg, M. J. E. The Phyre2 web portal for protein modeling, prediction and analysis. Nature Protocols. 10 (6), 845-858 (2015).
  41. Bamshad, M. J., et al. The Centers for Mendelian Genomics: A new large-scale initiative to identify the genes underlying rare Mendelian conditions. American Journal of Medical Genetics Part A. 158 (7), 1523-1525 (2012).
  42. Sobreira, N. L. M., et al. Matchmaker Exchange. Current Protocols in Human Genetics. 95, 1-15 (2017).
  43. Temple, G., et al. The completion of the Mammalian Gene Collection (MGC). Genome Research. 19 (12), 2324-2333 (2009).
  44. Katzen, F. Gateway ®Recombinational cloning: a biological operating system. Expert Opinion on Drug Discovery. 2 (4), 571-589 (2007).
  45. Venken, K. J. T., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: A BAC Transgenic Platform for Targeted Insertion of Large DNA Fragments in D. melanogaster. Science. 314 (5806), 1747-1751 (2006).
  46. Bischof, J., et al. A versatile platform for creating a comprehensive UAS-ORFeome library in Drosophila. Development. 140 (11), 2434-2442 (2013).
  47. Bischof, J., Sheils, E. M., Björklund, M., Basler, K. Generation of a transgenic ORFeome library in Drosophila. Nature Protocols. 9 (7), 1607-1620 (2014).
  48. Laible, M., Boonrod, K. Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids. Journal of Visualized Experiments. (27), e1135 (2009).
  49. Balana, B., Taylor, N., Slesinger, P. A. Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells. Journal of Visualized Experiments. (44), e2189 (2010).
  50. Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific C31 integrases. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (9), 3312-3317 (2007).
  51. Ringrose, L. Transgenesis in Drosophila melanogaster. Methods in Molecular Biology. 561, 3-19 (2009).
  52. Venken, K. J. T., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: A BAC Transgenic Platform for Targeted Insertion of Large DNA Fragments in D. melanogaster. Science. 314 (5806), 1747-1751 (2006).
  53. Groth, A. C., Fish, M., Nusse, R., Calos, M. P. Construction of transgenic Drosophila by using the site-specific integrase from phage phiC31. Génétique. 166 (4), 1775-1782 (2004).
  54. Greenspan, R. . Fly Pushing: The Thory and Practice of Drosophila Genetics. , (2004).
  55. Ashburner, M., Golic, K., Hawley, R. S. . Drosophila: A Laboratory Handbook. , (2005).
  56. Diao, F., White, B. H. A Novel Approach for Directing Transgene Expression in Drosophila: T2A-Gal4 In-Frame Fusion. Génétique. 190 (3), 1139-1144 (2012).
  57. Diao, F., et al. Plug-and-Play Genetic Access to Drosophila Cell Types using Exchangeable Exon Cassettes. Cell Reports. 10 (8), 1410-1421 (2015).
  58. Bellen, H. J., et al. The Drosophila Gene Disruption Project: Progress Using Transposons With Distinctive Site Specificities. Génétique. 188 (3), 731-743 (2011).
  59. Lee, P. -. T., et al. A gene-specific T2A-GAL4 library for Drosophila. eLife. 7, (2018).
  60. Venken, K. J. T., et al. MiMIC: a highly versatile transposon insertion resource for engineering Drosophila melanogaster genes. Nature Methods. 8 (9), 737-743 (2011).
  61. Li-Kroeger, D., et al. An expanded toolkit for gene tagging based on MiMIC and scarless CRISPR tagging in Drosophila. eLife. 7, (2018).
  62. Salazar, J. L., Yamamoto, S. Integration of Drosophila and Human Genetics to Understand Notch Signaling Related Diseases. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1066, 141-185 (2018).
  63. Wangler, M. F., Yamamoto, S., Bellen, H. J. Fruit Flies in Biomedical Research. Génétique. 199 (3), 639-653 (2015).
  64. Duffy, J. B. GAL4 system indrosophila: A fly geneticist’s swiss army knife. Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
  65. Nagarkar-Jaiswal, S., et al. A library of MiMICs allows tagging of genes and reversible, spatial and temporal knockdown of proteins in Drosophila. eLife. 4, (2015).
  66. Dolph, P., Nair, A., Raghu, P. . Electroretinogram Recordings of Drosophila. (1), (2011).
  67. Lauwers, E., Verstreken, P. Assaying Mutants of Clathrin-Mediated Endocytosis in the Fly Eye. Methods in Molecular Biology. 1847, 109-119 (2018).
  68. Rhodes-Mordov, E., Samra, H., Minke, B. Electroretinogram (ERG) Recordings from Drosophila. Bio-Protocol. 5 (21), (2015).
  69. Deal, S., Yamamoto, S. Unraveling novel mechanisms of neurodegeneration through a large-scale forward genetic screen in Drosophila. Frontiers in Genetics. , (2019).
  70. Chouhan, A. K., et al. Uncoupling neuronal death and dysfunction in Drosophila models of neurodegenerative disease. Acta Neuropathologica Communications. 4 (1), 62 (2016).
  71. Lek, M., et al. Analysis of protein-coding genetic variation in 60,706 humans. Nature. 536 (7616), 285-291 (2016).
  72. Liberg, D., Sigvardsson, M., Akerblad, P. The EBF/Olf/Collier family of transcription factors: regulators of differentiation in cells originating from all three embryonal germ layers. Molecular and Cellular Biology. 22 (24), 8389-8397 (2002).
  73. Prasad, B. C., et al. Unc-3, a gene required for axonal guidance in Caenorhabditis elegans, encodes a member of the O/E family of transcription factors. Development. 125 (8), 1561-1568 (1998).
  74. Jinushi-Nakao, S., et al. Knot/Collier and Cut Control Different Aspects of Dendrite Cytoskeleton and Synergize to Define Final Arbor Shape. Neuron. 56 (6), 963-978 (2007).
  75. Pozzoli, O., Bosetti, A., Croci, L., Consalez, G. G., Vetter, M. L. Xebf3 is a regulator of neuronal differentiation during primary neurogenesis in Xenopus. Biologie du développement. 233 (2), 495-512 (2001).
  76. Wang, S. S., Lewcock, J. W., Feinstein, P., Mombaerts, P., Reed, R. R. Genetic disruptions of O/E2 and O/E3 genes reveal involvement in olfactory receptor neuron projection. Development. 131 (6), 1377-1388 (2004).
  77. Fulp, C. T., et al. Identification of Arx transcriptional targets in the developing basal forebrain. Human Molecular Genetics. 17 (23), 3740-3760 (2008).
  78. Gécz, J., Cloosterman, D., Partington, M. ARX: a gene for all seasons. Current Opinion in Genetics & Development. 16 (3), 308-316 (2006).
  79. Dubois, L., Vincent, A. The COE–Collier/Olf1/EBF–transcription factors: structural conservation and diversity of developmental functions. Mechanisms of Development. 108 (1-2), 3-12 (2001).
  80. Cook, R. K., et al. The generation of chromosomal deletions to provide extensive coverage and subdivision of the Drosophila melanogaster genome. Genome Biology. 13 (3), 21 (2012).
  81. Chao, H. -. T., et al. A Syndromic Neurodevelopmental Disorder Caused by De Novo Variants in EBF3. The American Journal of Human Genetics. 100 (1), 128-137 (2017).
  82. Sleven, H., et al. De Novo Mutations in EBF3 Cause a Neurodevelopmental Syndrome. The American Journal of Human Genetics. 100 (1), 138-150 (2017).
  83. Harms, F. L., et al. Mutations in EBF3 Disturb Transcriptional Profiles and Cause Intellectual Disability, Ataxia, and Facial Dysmorphism. The American Journal of Human Genetics. 100 (1), 117-127 (2017).
  84. Tanaka, A. J., et al. De novo variants in EBF3 are associated with hypotonia, developmental delay, intellectual disability, and autism. Molecular Case Studies. 3 (6), 002097 (2017).
  85. Blackburn, P. R., et al. Novel de novo variant in EBF3 is likely to impact DNA binding in a patient with a neurodevelopmental disorder and expanded phenotypes: patient report, in silico functional assessment, and review of published cases. Molecular Case Studies. 3 (3), 001743 (2017).
  86. Lopes, F., Soares, G., Gonçalves-Rocha, M., Pinto-Basto, J., Maciel, P. Whole Gene Deletion of EBF3 Supporting Haploinsufficiency of This Gene as a Mechanism of Neurodevelopmental Disease. Frontiers in Genetics. 8, 143 (2017).
  87. Liu, N., et al. Functional variants in TBX2 are associated with a syndromic cardiovascular and skeletal developmental disorder. Human Molecular Genetics. 27 (14), 2454-2465 (2018).
  88. Mesbah, K., et al. Identification of a Tbx1/Tbx2/Tbx3 genetic pathway governing pharyngeal and arterial pole morphogenesis. Human Molecular Genetics. 21 (6), 1217-1229 (2012).
  89. Bellen, H. J., Yamamoto, S. Morgan’s legacy: fruit flies and the functional annotation of conserved genes. Cell. 163 (1), 12-14 (2015).
  90. Richards, S., et al. Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology. Genetics in Medicine. 17 (5), 405-423 (2015).
  91. McGary, K. L., Park, T. J., Woods, J. O., Cha, H. J., Wallingford, J. B., Marcotte, E. M. Systematic discovery of nonobvious human disease models through orthologous phenotypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (14), 6544-6549 (2010).
  92. Yamamoto, S., et al. A Drosophila Genetic Resource of Mutants to Study Mechanisms Underlying Human Genetic Diseases. Cell. 159, 200-214 (2014).
  93. Ausubel, F. M. . Current Protocols in Molecular Biology. , (1989).
  94. Rubin, G., Spradling, A. Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors. Science. 218 (4570), 348-353 (1982).
  95. Sun, Y., Sriramajayam, K., Luo, D., Liao, D. J. A Quick, Cost-Free Method of Purification of DNA Fragments from Agarose Gel. Journal of Cancer. 3, 93-95 (2012).
  96. Ronaghi, M. DNA Sequencing :A Sequencing Method Based on Real-Time Pyrophosphate. Science. 281 (5375), 363-365 (1998).
  97. Ho, S. N., Hunt, H. D., Horton, R. M., Pullen, J. K., Pease, L. R. Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction. Gene. 77 (1), 51-59 (1989).

Tags

DrosophilaIn Vivo Functional StudyRare Human VariantsDisease-associated VariantsProtein FunctionRescue ExperimentsOverexpression StudiesGal4-UAS SystemVisual SystemPhotoreceptors
check_url/fr/59658?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Harnish, J. M., Deal, S. L., Chao, H., Wangler, M. F., Yamamoto, S. In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila. J. Vis. Exp. (150), e59658, doi:10.3791/59658 (2019).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image