JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Génétique

In vivo funktionel undersøgelse af sygdoms associerede sjældne humane varianter ved hjælp af Drosophila

Published: August 20, 2019
doi:
10.3791/59658
, , , ,
1Department of Molecular and Human Genetics,Baylor College of Medicine, 2Program in Developmental Biology,Baylor College of Medicine, 3Department of Pediatrics, Section of Neurology and Developmental Neuroscience,Baylor College of Medicine, 4Jan and Dan Duncan Neurological Research Institute,Texas Children’s Hospital, 5Department of Neuroscience,Baylor College of Medicine

Summary

Formålet med denne protokol er at skitsere design og udførelse af in vivo eksperimenter i Drosophila melanogaster for at vurdere de funktionelle konsekvenser af sjældne genvarianter forbundet med sygdomme hos mennesker.

Abstract

Fremskridt i sekvensering teknologi har gjort helgenom og hel-exome datasæt mere tilgængelige for både klinisk diagnose og banebrydende humangenetik forskning. Selv om der er udviklet en række in silico-algoritmer til at forudsige patogeniciteten af varianter, der er identificeret i disse datasæt, er funktionelle undersøgelser afgørende for at bestemme, hvordan specifikke genomvarianter påvirker protein funktionen, især for missense Varianter. I netværket af udiagnosticerede sygdomme (UDN) og andre forskningskonsortier for sjældne sygdomme, anvendes modelorganismer (MO), herunder Drosophila, C. elegans, zebrafish og mus, til at vurdere funktionen af formodede humane sygdomsfremkaldende Varianter. Denne protokol beskriver en metode til funktionel vurdering af sjældne humane varianter, der anvendes i modellen organismer screening Center Drosophila kernen af udn. Arbejdsprocessen begynder med indsamling af menneskelige og MO-oplysninger fra flere offentlige databaser ved hjælp af MARRVEL-webressourcen for at vurdere, om varianten sandsynligvis vil bidrage til en patients tilstand, samt udforme effektive eksperimenter baseret på tilgængelige viden og ressourcer. Dernæst genereres genetiske værktøjer (f. eks. T2A-GAL4 og UAS-humane cDNA-linjer) for at vurdere funktionerne af varianter af interesse i Drosophila. Ved udvikling af disse reagenser, to-strenget funktionelle assays baseret på redning og overekspression eksperimenter kan udføres for at vurdere variant funktion. I rednings grenen er de endogene flue gener “humaniseret” ved at erstatte det ortoloøse Drosophila -gen med reference eller variant humane transgener. I overekspression gren, er reference og variant humane proteiner eksogent drevet i en række forskellige væv. I begge tilfælde kan enhver brændende fænotype (f. eks. dødelighed, øjen morfologi, Elektrofysiologi) anvendes som en udlæsning, uanset hvilken sygdom der er af interesse. Forskelle observeret mellem reference og variant alleler tyder på en variant-specifik effekt, og dermed sandsynligvis patogenicitet. Denne protokol giver mulighed for hurtige, in vivo vurderinger af formodede menneskelige sygdomsfremkaldende varianter af gener med kendte og ukendte funktioner.

Introduction

Patienter med sjældne sygdomme gennemgår ofte en besværlig rejse benævnt “diagnostisk Odyssey” for at opnå en nøjagtig diagnose1. De fleste sjældne sygdomme menes at have en stærk genetisk oprindelse, hvilket gør genetisk/genomisk analyse af kritiske elementer i det kliniske arbejdsforhold. Ud over kandidat genpanel sekvensering og kopi nummer variation analyse baseret på kromosomale mikroarrays, hele exome (Wes) og hel-Genome sekventering (WGS) teknologier er blevet stadig mere værdifulde værktøjer i løbet af de sidste årti2, 3. I øjeblikket, den diagnostiske sats for at identificere en kendt patogene variant i Wes og WGS er ~ 25% (højere i pædiatriske tilfælde)4,5. For de fleste tilfælde, der forbliver udiagnosticeret efter kliniske WES/WGS, et almindeligt problem er, at der er mange kandidat gener og varianter. Næste generations sekvensering identificerer ofte nye eller ultra-sjældne varianter i mange gener og fortolker, om disse varianter bidrager til sygdoms fænotyper, er udfordrende. For eksempel, selv om de fleste nonsens eller frameshift mutationer i gener menes at være tab-of-funktion (LOF) alleler på grund af nonsens-medieret henfald af den kodede afskrift, afkortning mutationer fundet i de sidste exons undslippe denne proces og kan fungere som godartet eller forstærknings funktion (GOF) alleler6.

Desuden, forudsige virkningerne af en missense allel er en skræmmende opgave, da det kan resultere i en række forskellige genetiske scenarier som første beskrevet af Herman Muller i 1930 ‘ erne (dvs., Amorph, hypomorph, hypermorph, antimorph, neomorph, eller isomorph)7 . Talrige i silico programmer og metoder er blevet udviklet til at forudsige patogenicitet af missense varianter baseret på evolutionære bevaring, type af aminosyre ændring, position inden for et funktionelt domæne, allel hyppighed i den almindelige befolkning, og andre parametre8. Men disse programmer er ikke en omfattende løsning til at løse det komplicerede problem med variant fortolkning. Interessant, en nylig undersøgelse viste, at fem bredt anvendte varianten patogenicitet forudsigelse algoritmer (Polyphen9, SIFT10, cadd11, Provean12, mutation smagsprøve) enige om patogenicitet ~ 80% af tiden8 . Især, selv når alle algoritmer er enige, de returnerer en ukorrekt forudsigelse af patogenicitet op til 11% af tiden. Dette fører ikke kun til fejlagtig klinisk fortolkning, men kan også afskrække forskere fra at følge op på nye varianter ved fejlagtigt at opføre dem som godartede. En måde at supplere den nuværende begrænsning af i silico modellering er at tilvejebringe eksperimentelle data, der viser effekten af variant funktionen in vitro, ex vivo (f. eks. dyrkede celler, organoider) eller in vivo.

In vivo funktionelle undersøgelser af sjældne sygdomme associerede varianter i MO har unikke styrker13 og er blevet vedtaget af mange sjældne sygdoms forskning initiativer rundt om i verden, herunder de udiagnosticerede sygdomme netværk (udn) i USA og sjældne Sygdomme modeller & mekanismer (RDMM) netværk i Canada, Japan, Europa og Australien14. Ud over disse koordinerede bestræbelser på at integrere MO-forskere i arbejdsgangen for diagnosticering af sjældne sygdomme og Mekanistiske undersøgelser på nationalt plan har en række individuelle samarbejds undersøgelser mellem kliniske og MO-forskere ført til opdagelsen og karakterisering af mange nye menneskelige sygdomsfremkaldende gener og varianter82,83,84.

I UDN modtager en centraliseret model organismer screening Center (MOSC) indsendelse af kandidat gener og varianter med en beskrivelse af patientens tilstand og vurderer, om varianten sandsynligvis vil være sygdomsfremkaldende ved hjælp af edb-værktøjer og in vivo Eksperimenter. I fase i (2015-2018) af UDN bestod MOSC af en Drosophila Core [Baylor College of MEDICINE (bcm)] og Zebrafish Core (University of Oregon), der arbejdede sammen om at vurdere sagerne. Ved hjælp af informatik analyse og en række forskellige eksperimentelle strategier i Drosophila og zebrafish, har mosc hidtil bidraget til diagnosticering af 132 patienter, identifikation af 31 nye syndromer55, opdagelse af flere nye menneskelige sygdomsgener (f. eks. EBF315, ATP5F1D16, TBX217, IRF2BPL18, COG419, WDR3720) og fænotypiske ekspansion af kendt sygdom gener (f. eks. CACNA1A21, ACOX122).

Ud over projekter inden for UDN har MOSC Drosophila kerne forskere bidraget til nye sygdoms genopdagelser i samarbejde med centrene for Mendelian Genomics og andre initiativer (f. eks. ANKLE223, TM2D3 24, NRD125, ogdhl25, ATAD3A26, ARIH127, MARK328, dnmbp29) ved hjælp af samme sæt af informatik og genetiske strategier udviklet til UDN. I betragtning af betydningen af MO undersøgelser om sjældne sygdomme diagnose, MOSC blev udvidet til at omfatte en C. elegans kerne og anden Zebrafish kerne (både på Washington University ved St. Louis) for fase II (2018-2022) af udn.

Dette manuskript beskriver en in vivo funktionel studie protokol, der bruges aktivt i UDN MOSC Drosophila kerne til at afgøre, om missense varianter har funktionelle konsekvenser på det protein af interesse ved hjælp af transgene fluer, der udtrykker menneskelig Proteiner. Målet med denne protokol er at hjælpe MO forskere med at arbejde sammen med kliniske forskningsgrupper for at tilvejebringe eksperimentelle beviser for, at en kandidat variant i et gen af interesse har funktionelle konsekvenser, hvilket letter den kliniske diagnose. Denne protokol er mest nyttig i et scenarie, hvor en Drosophila forsker kontaktes af en klinisk investigator, der har en sjælden sygdom patient med en specifik kandidat variant i et gen af interesse.

Denne protokol kan opdeles i tre elementer: (1) indsamling af oplysninger for at vurdere sandsynligheden for, at varianten af interesse er ansvarlig for patientens fænotype og gennemførligheden af en funktionel undersøgelse i Drosophila, (2) indsamling eksisterende genetiske værktøjer og etablering af nye, og (3) udførelse af funktionelle undersøgelser in vivo. Det tredje element kan yderligere opdeles i to underelementer baseret på, hvordan funktionen af en variant af interesse kan vurderes (redningsforsøg eller overekspressions baserede strategier). Det er vigtigt at bemærke, at denne protokol kan tilpasses og optimeres til mange scenarier uden for sjældne monogen sygdoms forskning (f. eks. almindeligt forekommende sygdomme, interaktioner mellem gener og miljø og farmakologiske/genetiske skærme for at identificere terapeutiske mål). Evnen til at bestemme variabilitet og patogenicitet af varianter vil ikke kun gavne patienten af interesse ved at give præcise molekylære diagnose, men vil også have en bredere indvirkning på både translationel og grundlæggende videnskabelig forskning.

Protocol

1. indsamling af menneskelige og MO oplysninger til at vurdere: sandsynligheden for en variant af interesse er ansvarlig for sygdom fænotyper og gennemførlighed af funktionelle undersøgelser i Drosophila Udføre omfattende database og litteratursøgninger for at afgøre, om de specifikke gener og varianter af interesse er gode kandidater til at forklare fænotype af patienten af interesse. Indsaml specifikt følgende oplysninger. Vurdere, om genet af interesse tidligere ha…

Representative Results

Funktionel undersøgelse af de Novo missense variant i EBF3 forbundet med neuroudviklingsmæssige fænotyperI en 7-årig mand med neuroudviklingsmæssige fænotyper, herunder hypotoni, ataksi, Global udviklingsmæssige forsinkelse, og udtryksfuld taleforstyrrelse, læger og menneskelige genetikere på National Institutes of Health udiagnosticerede sygdomme projekt (UDP) identificerede en de Novo missense variant (p. R163Q) i EBF3 (tidlig b-celle faktor 3)1…

Discussion

Eksperimentelle undersøgelser med Drosophila melanogaster giver et robust analyse system til at vurdere konsekvenserne af sygdomsrelaterede humane varianter. Dette skyldes den store mængde af viden og forskellige genetiske værktøjer, der er blevet genereret af mange forskere i flue marken i løbet af de sidste århundrede89. Ligesom ethvert andet eksperimentelt system er det imidlertid vigtigt at erkende de forbehold og begrænsninger, der findes.

F…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker Jose Salazar, Julia Wang, og Dr. Karen Schulze for kritisk læsning af manuskriptet. Vi anerkender DRs. ning Liu og XI Luo for den funktionelle karakterisering af de TBX2 varianter, som diskuteres her. Udiagnosticerede sygdomme netværk model organismer screening Center blev støttet gennem National Institutes of Health (NIH) fælles fond (U54 NS093793). H. T. C. blev yderligere støttet af NIH [CNCDP-K12 og NINDS (1K12 NS098482)], American Academy of Neurology (Neuroscience Research tilskud), Burroughs Wellcome fond (Career Award for medicinske videnskabsfolk), Child Neurology Society og Child Neurology Foundation ( PERF Elterman Grant) og NIH-direktørens tidlige uafhængigheds pris (DP5 OD026426). M. F. W. blev yderligere støttet af Simons Foundation (SFARI Award: 368479). S. Y. blev yderligere støttet af NIH (R01 DC014932), Simons Foundation (SFARI Award: 368479), Alzheimer’s Association (ny investigator forskning Grant: 15-364099), naman Familiefond for grundforskning, og Caroline Wiess lov fond for forskning i Molekylær medicin. Confocal mikroskopi hos BCM understøttes delvist af NIH Grant U54HD083092 til Neuro visualiserings kernen for intellektuel og udviklingsmæssige handicap Research Center (iddrc).

Materials

Drosophila Stocks for UAS-human cDNA transgenesis
Injection strains for transgenesis (D. melanogaster) BDSC #24871 Specific Reagent: VK33 (3rd chromosome) Injection line
Injection strains for transgenesis (D. melanogaster) BDSC #24872 Specific Reagent: VK37 (2nd chromosome) Injection line
Plasmid DNA
Cloning vector Thermo Fisher #12536-017 Specific Reagent: pDONR221
Drosophila transgenesis vector Gift from Drs. Johannes Bischof and Konrad Basler (Bischof et al., 2013 PNAS) Specific Reagent: pGW-HA.attB
Molecular biology kits and reagents
Agarose Sigma-Aldrich #A2790 Specific Reagent: Agarose (molecular biology grade)
Chemically Competent Cells (E. coli) Thermo Fisher #18265017 Specific Reagent: DH5α
DNA Gel Extraction kit Thermo Fisher #K210012 Specific Reagent: PureLink Gel Extraction Kit
DNA Isolation and purification kit Qiagen #27104 Specific Reagent: QIAprep Spin Miniprep Kit
High Fidelity Polymerase NEB #M0491 Specific Reagent: Q5 Polymerase kit
Recombinase mediated cloning system Thermo Fisher #11789020 Specific Reagent: Gateway BP Clonase kit
Recombinase mediated cloning system Thermo Fisher #11791100 Specific Reagent: Gateway LR Clonase II Enzyme kit
Site Directed Mutagenesis kit Agilent #200523 Specific Reagent: Quick Change II Mutagenesis kit
Electroretinogram Rig related equipment
ERG Analysis Molecular Devices N/A Specific Reagent: Axon pCLAMP 10 Data Software Package
ERG Data Collection LabX #R150358 Specific Reagent: ISO-DAM Isolated Biologic Amplifier
ERG Stimulator Astro-Med #S48 Specific Reagent: Square Pulse Stimulator
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boycott, K. M., et al. International Cooperation to Enable the Diagnosis of All Rare Genetic Diseases. The American Journal of Human Genetics. 100 (5), 695-705 (2017).
  2. Lupski, J. R., et al. Whole-Genome Sequencing in a Patient with Charcot-Marie-Tooth Neuropathy. New England Journal of Medicine. 362 (13), 1181-1191 (2010).
  3. Boycott, K. M., Vanstone, M. R., Bulman, D. E., MacKenzie, A. E. Rare-disease genetics in the era of next-generation sequencing: discovery to translation. Nature Reviews Genetics. 14 (10), 681-691 (2013).
  4. Yang, Y., et al. Molecular Findings Among Patients Referred for Clinical Whole-Exome Sequencing. JAMA. 312 (18), 1870 (2014).
  5. Lee, H., et al. Clinical Exome Sequencing for Genetic Identification of Rare Mendelian Disorders. JAMA. 312 (18), 1880 (2014).
  6. Coban-Akdemir, Z., et al. Identifying Genes Whose Mutant Transcripts Cause Dominant Disease Traits by Potential Gain-of-Function Alleles. The American Journal of Human Genetics. 103 (2), 171-187 (2018).
  7. Muller, H. J. Further studies on the nature and causes of gene mutations. Proceedings of the Sixth International Congress of Genetics. , 213-255 (1932).
  8. Ghosh, R., Oak, N., Plon, S. E. Evaluation of in silico algorithms for use with ACMG/AMP clinical variant interpretation guidelines. Genome Biology. 18 (1), 225 (2017).
  9. Adzhubei, I. A., et al. A method and server for predicting damaging missense mutations. Nature Methods. 7 (4), 248-249 (2010).
  10. Vaser, R., Adusumalli, S., Leng, S. N., Sikic, M., Ng, P. C. SIFT missense predictions for genomes. Nature Protocols. 11 (1), 1-9 (2016).
  11. Rentzsch, P., Witten, D., Cooper, G. M., Shendure, J. l., Kircher, M. CADD: predicting the deleteriousness of variants throughout the human genome. Nucleic Acids Research. , (2018).
  12. Choi, Y., Sims, G. E., Murphy, S., Miller, J. R., Chan, A. P. Predicting the functional effect of amino acid substitutions and indels. PloS ONE. 7 (10), 46688 (2012).
  13. Wangler, M. F., et al. Model Organisms Facilitate Rare Disease Diagnosis and Therapeutic Research. Génétique. 207 (1), 9-27 (2017).
  14. Oriel, C., Lasko, P. Recent Developments in Using Drosophila as a Model for Human Genetic Disease. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 2041 (2018).
  15. Chao, H. T., et al. A Syndromic Neurodevelopmental Disorder Caused by De Novo Variants in EBF3. American Journal of Human Genetics. 100 (1), 128-137 (2017).
  16. Oláhová, M., et al. Biallelic Mutations in ATP5F1D, which Encodes a Subunit of ATP Synthase, Cause a Metabolic Disorder. American Journal of Human Genetics. 102 (3), 494-504 (2018).
  17. Liu, N., et al. Functional variants in TBX2 are associated with a syndromic cardiovascular and skeletal developmental disorder. Human Molecular Genetics. 27 (14), 2454-2465 (2018).
  18. Marcogliese, P. C., et al. IRF2BPL Is Associated with Neurological Phenotypes. American Journal of Human Genetics. 103 (2), 245-260 (2018).
  19. Ferreira, C. R., et al. A Recurrent De Novo Heterozygous COG4 Substitution Leads to Saul-Wilson Syndrome, Disrupted Vesicular Trafficking, and Altered Proteoglycan Glycosylation. The American Journal of Human Genetics. 103 (4), 553-567 (2018).
  20. Kanca, O., et al. De novo variants in WDR37 are associated with epilepsy, colobomas and cerebellar hypoplasia. Americal Journal of Human Genetics. , (2019).
  21. Luo, X., et al. Clinically severe CACNA1A alleles affect synaptic function and neurodegeneration differentially. PLOS Genetics. 13 (7), 1006905 (2017).
  22. Chung, H., et al. ACOX1 induces autoimmunity whereas a de novo gain of function variant induces elevated ROS and glial loss in humans and flies. Cell Metabolism. , (2019).
  23. Yamamoto, S., et al. A Drosophila Genetic Resource of Mutants to Study Mechanisms Underlying Human Genetic Diseases. Cell. 159 (1), 200-214 (2014).
  24. Jakobsdottir, J., et al. Rare Functional Variant in TM2D3 is Associated with Late-Onset Alzheimer’s Disease. PLoS Genetics. 12 (10), 1006327 (2016).
  25. Yoon, W. H., et al. Loss of Nardilysin, a Mitochondrial Co-chaperone for α-Ketoglutarate Dehydrogenase, Promotes mTORC1 Activation and Neurodegeneration. Neuron. 93 (1), 115-131 (2017).
  26. Harel, T., et al. Recurrent De Novo and Biallelic Variation of ATAD3A, Encoding a Mitochondrial Membrane Protein, Results in Distinct Neurological Syndromes. American Journal of Human Genetics. 99 (4), 831-845 (2016).
  27. Tan, K. L., et al. Ari-1 Regulates Myonuclear Organization Together with Parkin and Is Associated with Aortic Aneurysms. Developmental Cell. 45 (2), 226-244 (2018).
  28. Ansar, M., et al. Visual impairment and progressive phthisis bulbi caused by recessive pathogenic variant in MARK3. Human Molecular Genetics. 27 (15), 2703-2711 (2018).
  29. Ansar, M., et al. Bi-allelic Loss-of-Function Variants in DNMBP Cause Infantile Cataracts. The American Journal of Human Genetics. 103 (4), 568-578 (2018).
  30. Wang, J., et al. MARRVEL: Integration of Human and Model Organism Genetic Resources to Facilitate Functional Annotation of the Human Genome. The American Journal of Human Genetics. 100 (6), 843-853 (2017).
  31. Wang, J., Liu, Z., Bellen, H., Yamamoto, S. MARRVEL, a web-based tool that integrates human and model organism genomics information. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
  32. Mungall, C. J., et al. The Monarch Initiative: an integrative data and analytic platform connecting phenotypes to genotypes across species. Nucleic Acids Research. 45, 712-722 (2017).
  33. Hu, Y., Comjean, A., Mohr, S. E., Perrimon, N., Perrimon, N. Gene2Function: An Integrated Online Resource for Gene Function Discovery. Genes|Genomes|Genetics. 7 (8), 2855-2858 (2017).
  34. Ioannidis, N. M., et al. An Ensemble Method for Predicting the Pathogenicity of Rare Missense Variants. The American Journal of Human Genetics. 99 (4), 877-885 (2016).
  35. Szklarczyk, D., et al. The STRING database in 2017: quality-controlled protein–protein association networks, made broadly accessible. Nucleic Acids Research. 45 (1), 362-368 (2017).
  36. Hu, Y., et al. Molecular Interaction Search Tool (MIST): an integrated resource for mining gene and protein interaction data. Nucleic Acids Research. 46 (1), 567-574 (2018).
  37. Lawson, C. L., et al. EMDataBank unified data resource for 3DEM. Nucleic Acids Research. 44 (1), 396-403 (2016).
  38. Bienert, S., et al. The SWISS-MODEL Repository-new features and functionality. Nucleic Acids Research. 45 (1), 313-319 (2017).
  39. Webb, B., Sali, A. Comparative Protein Structure Modeling Using MODELLER. Current Protocols in Bioinformatics. 54, 1-37 (2016).
  40. Kelley, L. A., Mezulis, S., Yates, C. M., Wass, M. N., Sternberg, M. J. E. The Phyre2 web portal for protein modeling, prediction and analysis. Nature Protocols. 10 (6), 845-858 (2015).
  41. Bamshad, M. J., et al. The Centers for Mendelian Genomics: A new large-scale initiative to identify the genes underlying rare Mendelian conditions. American Journal of Medical Genetics Part A. 158 (7), 1523-1525 (2012).
  42. Sobreira, N. L. M., et al. Matchmaker Exchange. Current Protocols in Human Genetics. 95, 1-15 (2017).
  43. Temple, G., et al. The completion of the Mammalian Gene Collection (MGC). Genome Research. 19 (12), 2324-2333 (2009).
  44. Katzen, F. Gateway ®Recombinational cloning: a biological operating system. Expert Opinion on Drug Discovery. 2 (4), 571-589 (2007).
  45. Venken, K. J. T., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: A BAC Transgenic Platform for Targeted Insertion of Large DNA Fragments in D. melanogaster. Science. 314 (5806), 1747-1751 (2006).
  46. Bischof, J., et al. A versatile platform for creating a comprehensive UAS-ORFeome library in Drosophila. Development. 140 (11), 2434-2442 (2013).
  47. Bischof, J., Sheils, E. M., Björklund, M., Basler, K. Generation of a transgenic ORFeome library in Drosophila. Nature Protocols. 9 (7), 1607-1620 (2014).
  48. Laible, M., Boonrod, K. Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids. Journal of Visualized Experiments. (27), e1135 (2009).
  49. Balana, B., Taylor, N., Slesinger, P. A. Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells. Journal of Visualized Experiments. (44), e2189 (2010).
  50. Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific C31 integrases. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (9), 3312-3317 (2007).
  51. Ringrose, L. Transgenesis in Drosophila melanogaster. Methods in Molecular Biology. 561, 3-19 (2009).
  52. Venken, K. J. T., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: A BAC Transgenic Platform for Targeted Insertion of Large DNA Fragments in D. melanogaster. Science. 314 (5806), 1747-1751 (2006).
  53. Groth, A. C., Fish, M., Nusse, R., Calos, M. P. Construction of transgenic Drosophila by using the site-specific integrase from phage phiC31. Génétique. 166 (4), 1775-1782 (2004).
  54. Greenspan, R. . Fly Pushing: The Thory and Practice of Drosophila Genetics. , (2004).
  55. Ashburner, M., Golic, K., Hawley, R. S. . Drosophila: A Laboratory Handbook. , (2005).
  56. Diao, F., White, B. H. A Novel Approach for Directing Transgene Expression in Drosophila: T2A-Gal4 In-Frame Fusion. Génétique. 190 (3), 1139-1144 (2012).
  57. Diao, F., et al. Plug-and-Play Genetic Access to Drosophila Cell Types using Exchangeable Exon Cassettes. Cell Reports. 10 (8), 1410-1421 (2015).
  58. Bellen, H. J., et al. The Drosophila Gene Disruption Project: Progress Using Transposons With Distinctive Site Specificities. Génétique. 188 (3), 731-743 (2011).
  59. Lee, P. -. T., et al. A gene-specific T2A-GAL4 library for Drosophila. eLife. 7, (2018).
  60. Venken, K. J. T., et al. MiMIC: a highly versatile transposon insertion resource for engineering Drosophila melanogaster genes. Nature Methods. 8 (9), 737-743 (2011).
  61. Li-Kroeger, D., et al. An expanded toolkit for gene tagging based on MiMIC and scarless CRISPR tagging in Drosophila. eLife. 7, (2018).
  62. Salazar, J. L., Yamamoto, S. Integration of Drosophila and Human Genetics to Understand Notch Signaling Related Diseases. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1066, 141-185 (2018).
  63. Wangler, M. F., Yamamoto, S., Bellen, H. J. Fruit Flies in Biomedical Research. Génétique. 199 (3), 639-653 (2015).
  64. Duffy, J. B. GAL4 system indrosophila: A fly geneticist’s swiss army knife. Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
  65. Nagarkar-Jaiswal, S., et al. A library of MiMICs allows tagging of genes and reversible, spatial and temporal knockdown of proteins in Drosophila. eLife. 4, (2015).
  66. Dolph, P., Nair, A., Raghu, P. . Electroretinogram Recordings of Drosophila. (1), (2011).
  67. Lauwers, E., Verstreken, P. Assaying Mutants of Clathrin-Mediated Endocytosis in the Fly Eye. Methods in Molecular Biology. 1847, 109-119 (2018).
  68. Rhodes-Mordov, E., Samra, H., Minke, B. Electroretinogram (ERG) Recordings from Drosophila. Bio-Protocol. 5 (21), (2015).
  69. Deal, S., Yamamoto, S. Unraveling novel mechanisms of neurodegeneration through a large-scale forward genetic screen in Drosophila. Frontiers in Genetics. , (2019).
  70. Chouhan, A. K., et al. Uncoupling neuronal death and dysfunction in Drosophila models of neurodegenerative disease. Acta Neuropathologica Communications. 4 (1), 62 (2016).
  71. Lek, M., et al. Analysis of protein-coding genetic variation in 60,706 humans. Nature. 536 (7616), 285-291 (2016).
  72. Liberg, D., Sigvardsson, M., Akerblad, P. The EBF/Olf/Collier family of transcription factors: regulators of differentiation in cells originating from all three embryonal germ layers. Molecular and Cellular Biology. 22 (24), 8389-8397 (2002).
  73. Prasad, B. C., et al. Unc-3, a gene required for axonal guidance in Caenorhabditis elegans, encodes a member of the O/E family of transcription factors. Development. 125 (8), 1561-1568 (1998).
  74. Jinushi-Nakao, S., et al. Knot/Collier and Cut Control Different Aspects of Dendrite Cytoskeleton and Synergize to Define Final Arbor Shape. Neuron. 56 (6), 963-978 (2007).
  75. Pozzoli, O., Bosetti, A., Croci, L., Consalez, G. G., Vetter, M. L. Xebf3 is a regulator of neuronal differentiation during primary neurogenesis in Xenopus. Biologie du développement. 233 (2), 495-512 (2001).
  76. Wang, S. S., Lewcock, J. W., Feinstein, P., Mombaerts, P., Reed, R. R. Genetic disruptions of O/E2 and O/E3 genes reveal involvement in olfactory receptor neuron projection. Development. 131 (6), 1377-1388 (2004).
  77. Fulp, C. T., et al. Identification of Arx transcriptional targets in the developing basal forebrain. Human Molecular Genetics. 17 (23), 3740-3760 (2008).
  78. Gécz, J., Cloosterman, D., Partington, M. ARX: a gene for all seasons. Current Opinion in Genetics & Development. 16 (3), 308-316 (2006).
  79. Dubois, L., Vincent, A. The COE–Collier/Olf1/EBF–transcription factors: structural conservation and diversity of developmental functions. Mechanisms of Development. 108 (1-2), 3-12 (2001).
  80. Cook, R. K., et al. The generation of chromosomal deletions to provide extensive coverage and subdivision of the Drosophila melanogaster genome. Genome Biology. 13 (3), 21 (2012).
  81. Chao, H. -. T., et al. A Syndromic Neurodevelopmental Disorder Caused by De Novo Variants in EBF3. The American Journal of Human Genetics. 100 (1), 128-137 (2017).
  82. Sleven, H., et al. De Novo Mutations in EBF3 Cause a Neurodevelopmental Syndrome. The American Journal of Human Genetics. 100 (1), 138-150 (2017).
  83. Harms, F. L., et al. Mutations in EBF3 Disturb Transcriptional Profiles and Cause Intellectual Disability, Ataxia, and Facial Dysmorphism. The American Journal of Human Genetics. 100 (1), 117-127 (2017).
  84. Tanaka, A. J., et al. De novo variants in EBF3 are associated with hypotonia, developmental delay, intellectual disability, and autism. Molecular Case Studies. 3 (6), 002097 (2017).
  85. Blackburn, P. R., et al. Novel de novo variant in EBF3 is likely to impact DNA binding in a patient with a neurodevelopmental disorder and expanded phenotypes: patient report, in silico functional assessment, and review of published cases. Molecular Case Studies. 3 (3), 001743 (2017).
  86. Lopes, F., Soares, G., Gonçalves-Rocha, M., Pinto-Basto, J., Maciel, P. Whole Gene Deletion of EBF3 Supporting Haploinsufficiency of This Gene as a Mechanism of Neurodevelopmental Disease. Frontiers in Genetics. 8, 143 (2017).
  87. Liu, N., et al. Functional variants in TBX2 are associated with a syndromic cardiovascular and skeletal developmental disorder. Human Molecular Genetics. 27 (14), 2454-2465 (2018).
  88. Mesbah, K., et al. Identification of a Tbx1/Tbx2/Tbx3 genetic pathway governing pharyngeal and arterial pole morphogenesis. Human Molecular Genetics. 21 (6), 1217-1229 (2012).
  89. Bellen, H. J., Yamamoto, S. Morgan’s legacy: fruit flies and the functional annotation of conserved genes. Cell. 163 (1), 12-14 (2015).
  90. Richards, S., et al. Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology. Genetics in Medicine. 17 (5), 405-423 (2015).
  91. McGary, K. L., Park, T. J., Woods, J. O., Cha, H. J., Wallingford, J. B., Marcotte, E. M. Systematic discovery of nonobvious human disease models through orthologous phenotypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (14), 6544-6549 (2010).
  92. Yamamoto, S., et al. A Drosophila Genetic Resource of Mutants to Study Mechanisms Underlying Human Genetic Diseases. Cell. 159, 200-214 (2014).
  93. Ausubel, F. M. . Current Protocols in Molecular Biology. , (1989).
  94. Rubin, G., Spradling, A. Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors. Science. 218 (4570), 348-353 (1982).
  95. Sun, Y., Sriramajayam, K., Luo, D., Liao, D. J. A Quick, Cost-Free Method of Purification of DNA Fragments from Agarose Gel. Journal of Cancer. 3, 93-95 (2012).
  96. Ronaghi, M. DNA Sequencing :A Sequencing Method Based on Real-Time Pyrophosphate. Science. 281 (5375), 363-365 (1998).
  97. Ho, S. N., Hunt, H. D., Horton, R. M., Pullen, J. K., Pease, L. R. Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction. Gene. 77 (1), 51-59 (1989).

Tags

DrosophilaIn Vivo Functional StudyRare Human VariantsDisease-associated VariantsProtein FunctionRescue ExperimentsOverexpression StudiesGal4-UAS SystemVisual SystemPhotoreceptors
check_url/fr/59658?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Harnish, J. M., Deal, S. L., Chao, H., Wangler, M. F., Yamamoto, S. In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila. J. Vis. Exp. (150), e59658, doi:10.3791/59658 (2019).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image