Isolatie en cultuur van primaire aorta-endotheel cellen van miniatuur varkens
Summary
Er wordt een effectieve enzymatische methode voor de isolatie van primaire varkens aorta endotheel cellen (pAECs) beschreven. De geïsoleerde primaire pAECs kan worden gebruikt om de immuunrespons en coagulatie reactie bij xenotransplantatie te onderzoeken.
Abstract
Xenotransplantatie is een veelbelovende manier om het tekort aan menselijke organen op te lossen voor patiënten met eindstadium orgaanfalen, en het varken wordt beschouwd als een geschikte orgaan bron. Immuun afwijzing en coagulatie zijn twee belangrijke hindernissen voor het succes van xenotransplantatie. Vasculaire endotheliale cel (EC) letsel en dysfunctie zijn belangrijk voor de ontwikkeling van de ontsteking en coagulatie reacties bij xenotransplantatie. Zo is isolatie van varkens aorta endotheel cellen (pAECs) noodzakelijk voor het onderzoeken van de immuunafstoting en coagulatie reacties. Hier hebben we een eenvoudige enzymatische aanpak ontwikkeld voor de isolatie, karakterisering en uitbreiding van zeer gezuiverde pAECs van miniatuur varkens. Eerst werd het miniatuur varken verdoofd met ketamine, en een lengte van aorta werd weggesneden. Ten tweede werd het endotheliale oppervlak van aorta blootgesteld aan 0,005% Collagenase IV digestieve oplossing voor 15 min. ten derde werd het endotheeloppervlak van de aorta in slechts één richting met een celscraper (< 10 keer) geschuurd en niet gecomprimeerd tijdens het proces van Schrapen. Tot slot, de geïsoleerde pAECs van dag 3, en na passage 1 en passage 2, werden geïdentificeerd doorstroming cytometrie met een anti-CD31-antilichaam. De percentages van CD31-positieve cellen waren respectievelijk 97,4% ± 1,2%, 94,4% ± 1,1% en 92,4% ± 1,7% (gemiddelde ± SD). De concentratie van Collagenase IV, de spijsverterings tijd, de richting, en de frequentie en intensiteit van het schrapen zijn van cruciaal belang voor het verminderen van fibroblast besmetting en het verkrijgen van hoge zuiverheid en een groot aantal ECs. Concluderend, onze enzymatische methode is een uiterst effentieve methode voor het isoleren van ECs van het miniatuur varken aorta, en de cellen kunnen in vitro worden uitgebreid om de immuunrespons en coagulatie reacties bij xenotransplantatie te onderzoeken.
Introduction
Het tekort aan beschikbare organen voor transplantatie is een uitstekend probleem wereldwijd1. Volgens de Rode Kruis vereniging van China, slechts een klein aantal patiënten met eindstadium orgaan falen kreeg een geschikt orgaan in China in 2018.
Xenotransplantatie is een veelbelovende manier om het probleem van orgaan tekorten op te lossen. Varkens organen worden beschouwd als de meest geschikte organen voor de mens vanwege anatomische en fysiologische gelijkenissen2,3. Het falen van een varkens xenotransplantaatmodellen is is grotendeels gerelateerd aan de primaat immuunafstoting en coagulatie responsen. Varkens endotheel cellen (ECs) zijn kritisch, omdat deze cellen zijn de eerste om te communiceren met het primaat immuunsysteem, waaronder antilichamen, complement, cytokines, en immune cellen (bv, T-cellen, B-cellen, en macrofagen)4,5. Varkens ECs spelen een vitale rol in varkens orgel en eilandje xenotransplantatie6,7. Dus, ECs zijn belangrijke cellen voor het onderzoeken van de afwijzing en coagulatie reacties op een varken Graft. Isolatie van hoge kwaliteit varkens ECs is vereist voor xenotransplantatie onderzoek.
In pogingen om ECs te isoleren van verschillende organen (bijv. hart, nieren, lever en aorta), zijn verschillende protocollen gerapporteerd in een xenotransplantaat instelling8,9,10,11,12. Echter, het houden van een ultrapuur cultuur van geïsoleerde ECs is een uitstekend probleem in de standaardprotocollen. De verhoogde concentratie van de verteerde oplossing, de ongepaste digestie tijd en de intensiteit van de Schraap kunnen bijdragen aan de verhoogde fibroblast besmetting in de huidige studies8,10,13. Trouwens, de methode van geïsoleerde pAECs van miniatuur varkens is minder bestudeerd. Hier beschrijven we een geoptimaliseerde enzymatische methode om hooggezuiverde pAECs te isoleren van miniatuur varkens (Wuzhishan of Bama). Verschillende stappen in het protocol zijn ontworpen om fibroblast besmetting te verminderen en hoge zuiverheid ECs te verkrijgen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Endotheliale cellen worden vaak gebruikt in onderzoek van vasculaire dysfunctie, diabetes, weefselregeneratie, transplantatie, en kankers14,15,16,17,18. Om de biologie en functie van ECs in deze ziekten te begrijpen en te karakteriseren, zijn er talrijke methoden om de ECs van verschillende zieke organen of weefsels te isoleren, gemeld8…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Het werk werd gesteund door subsidies van Natural Science Foundation van de provincie Guangdong, Grant/Award nummer: 2016A030313028; Medisch wetenschappelijk onderzoek Stichting van de provincie Guangdong, Grant/Award nummer: B2018003; Shenzhen Foundation of Science and Technology, Grant/Award nummer: JCYJ20180306172449376, JCYJ20180306172459580, JCJY20160229204849975, GJHZ20170314171357556, JCYJ20160425103000011 en JCYJ20160428142040945; Shenzhen Longhua district Stichting van wetenschap en technologie, Grant/Award nummer: 2017013; Nationale sleutel R & D-programma van China, subsidie/Gunnings nummer: 2017YFC1103704; Sanming project van geneeskunde in Shenzhen, Grant/Award nummer: SZSM201412020; Speciale fondsen voor de bouw van ziekenhuizen op hoog niveau in de provincie Guangdong (2019); Fonds voor medische discipline op hoog niveau bouw van Shenzhen, Grant/Award nummer: 2016031638; Shenzhen Stichting van gezondheid en familie planning Commissie, Grant/Award nummer: SZXJ2017021 en SZXJ2018059. We bedanken Hancheng Zhang en Zhicheng zou van de Universiteit van Shenzhen voor het assisteren bij de voorbereiding van het manuscript.
Materials
| BD FACSAria II | BD Bioscience | ||
| Boneforceps | Beijing HeLi KeChuang Technology Development CO.,Ltd. China | HL-YGQ | |
| BOON Disposable Syringe (10ml) | Jiangsu Yile medical Article Co., Ltd. China | ||
| CD31-FITC antibody | Bio-Rad | MCA1746F | |
| Cell scraper | Corning | 3010# | |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138#-1G | |
| Compound ketamine injection | Veterinary Pharmaceutical Factory of Shenyang, China | Ketamine Hydrochloride：0.3g/2ml,Xylazine hydrochloride:0.3g/2ml, Phenacetin hydrochloride：1mg/2ml | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Life Technologies | D1306# | |
| DMEM | Life Technologies | 11965118# | |
| ECM | Sciencell | 1001# | |
| ECGS | Sciencell | 1052# | |
| Eppendorf Snap-Cap Microtube(1.5mL) | AXYGEN | MCT-150-C# | |
| Falcon 100mm Cell Culture Dish | Corning | 353003# | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | 10270-106# | |
| Flowjo v10.0 | |||
| Forceps | ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China | ||
| Heparin sodium | Jiangsu WanBang biopharmaceutical Co.,Ltd.China | ||
| Iodine tincture | Guilin LiFeng Medical Supplies Co.,Ltd.China | ||
| Miniature Pig (Bama or Wuzhishan) | Kang Yi Ecological Agriculture Co., Ltd, China | ||
| Mshot microscope | Guangzhou Micro-shot Technology Co., Ltd. | M152 | |
| Petri Dishes (150 x 15 mm) | Biologixgroup | 66-1515# | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070063# | |
| Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Vent Cap （T25） | Corning | 3289# | |
| Scissors | ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China | ||
| Serological Transfer Pipettes (10ml) | JET Biofil | GSP010010# | |
| Sterile Pasteur Pipette | GeneBrick | GY0025# | |
| Sterile Syringe Filter (0.22µm) | Millipore | SLGV033RS# | |
| Surgical scalpel | ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China | 22# | |
| Surgical suture | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., Ltd | 5-0# | |
| Syringe（5mL） | Shengguang Medical Instrument Co., Ltd.China | ||
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | GIBCO | 25200056# | |
| 75% Medical alcohol | Guilin LiFeng Medical Supplies Co.,Ltd.China | ||
| 20 x PBS solution (pH 7.4,Nuclease free) | Sangon Biotech | B540627# | |
| Medical disinfectant 84 liquid | Sichuan Province Yijieshi Medical Technology Co., Ltd | 450ml/bottle |
References
- Zhang, G. Y., Liao, T., Fu, X. B., Li, Q. F. Organ transplantation in China: concerns remain. Lancet. 385 (9971), 854-855 (2015).
- Ekser, B., et al. Clinical xenotransplantation: the next medical revolution?. Lancet. 379 (9816), 672-683 (2012).
- Cooper, D. K., Ekser, B., Ramsoondar, J., Phelps, C., Ayares, D. The role of genetically engineered pigs in xenotransplantation research. The Journal of Pathology. 238 (2), 288-299 (2016).
- Pober, J. S., Sessa, W. C. Evolving functions of endothelial cells in inflammation. Nature Reviews Immunology. 7 (10), 803-815 (2007).
- McGill, S. N., Ahmed, N. A., Christou, N. V. Endothelial cells: role in infection and inflammation. World Journal of Surgery. 22 (2), 171-178 (1998).
- Ekser, B., Cooper, D. K. Overcoming the barriers to xenotransplantation: prospects for the future. Expert Review of Clinical Immunology. 6 (2), 219-230 (2010).
- Yeom, H. J., et al. Porcine aortic endothelial cell genes responsive to selected inflammatory stimulators. The Journal of Veterinary Medical Science. 71 (11), 1499-1508 (2009).
- Beigi, F., et al. Optimized method for isolating highly purified and functional porcine aortic endothelial and smooth muscle cells. Journal of Cellular Physiology. 232 (11), 3139-3145 (2017).
- Jansen of Lorkeers, S. J., et al. Xenotransplantation of Human Cardiomyocyte Progenitor Cells Does Not Improve Cardiac Function in a Porcine Model of Chronic Ischemic Heart Failure. Results from a Randomized, Blinded, Placebo Controlled Trial. PLOS One. 10 (12), e0143953 (2015).
- Zhang, J., et al. Potential Antigens Involved in Delayed Xenograft Rejection in a Ggta1/Cmah Dko Pig-to-Monkey Model. Scientific Reports. 7 (1), 10024 (2017).
- Paris, L. L., et al. ASGR1 expressed by porcine enriched liver sinusoidal endothelial cells mediates human platelet phagocytosis in vitro. Xenotransplantation. 18 (4), 245-251 (2011).
- Paris, L. L., Chihara, R. K., Sidner, R. A., Tector, A. J., Burlak, C. Differences in human and porcine platelet oligosaccharides may influence phagocytosis by liver sinusoidal cells in vitro. Xenotransplantation. 19 (1), 31-39 (2012).
- Bernardini, C., et al. Heat shock protein 70, heat shock protein 32, and vascular endothelial growth factor production and their effects on lipopolysaccharide-induced apoptosis in porcine aortic endothelial cells. Cell Stress & Chaperones. 10 (4), 340-348 (2005).
- Endemann, D. H., Schiffrin, E. L. Endothelial dysfunction. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 15 (8), 1983-1992 (2004).
- Graupera, M., Claret, M. Endothelial Cells: New Players in Obesity and Related Metabolic Disorders. Trends in Endocrinology and Metabolism: TEM. 29 (11), 781-794 (2018).
- Kawamoto, A., Asahara, T., Losordo, D. W. Transplantation of endothelial progenitor cells for therapeutic neovascularization. Cardiovascular Radiation Medicine. 3 (3-4), 221-225 (2002).
- Rafii, S., Lyden, D. Therapeutic stem and progenitor cell transplantation for organ vascularization and regeneration. Nature Medicine. 9 (6), 702-712 (2003).
- Jain, R. K., et al. Endothelial cell death, angiogenesis, and microvascular function after castration in an androgen-dependent tumor: role of vascular endothelial growth factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (18), 10820-10825 (1998).
- Pratumvinit, B., Reesukumal, K., Janebodin, K., Ieronimakis, N., Reyes, M. Isolation, characterization, and transplantation of cardiac endothelial cells. BioMed Research International. 2013, 359412 (2013).
- Crouch, E. E., Doetsch, F. FACS isolation of endothelial cells and pericytes from mouse brain microregions. Nature Protocols. 13 (4), 738-751 (2018).
- Nakano, H., Nakano, K., Cook, D. N. Isolation and Purification of Epithelial and Endothelial Cells from Mouse Lung. Methods in Molecular Biology. 1799, 59-69 (2018).
- Naschberger, E., et al. Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma – An Improved Protocol. Journal of Visualized Experiments. (134), e57400 (2018).
- Yu, S., et al. Isolation and characterization of endothelial colony-forming cells from mononuclear cells of rat bone marrow. Experimental Cell Research. 370 (1), 116-126 (2018).
- Chi, L., Delgado-Olguin, P. Isolation and Culture of Mouse Placental Endothelial Cells. Methods in Molecular Biology. 1752, 101-109 (2018).
- Hawthorne, W. J., Lew, A. M., Thomas, H. E. Genetic strategies to bring islet xenotransplantation to the clinic. Current Opinion in Organ Transplantation. 21 (5), 476-483 (2016).
- Yi, E., et al. Mechanical Forces Accelerate Collagen Digestion by Bacterial Collagenase in Lung Tissue Strips. Frontiers in Physiology. 7, 287 (2016).
- Masson-Pevet, M., Jongsma, H. J., De Bruijne, J. Collagenase- and trypsin-dissociated heart cells: a comparative ultrastructural study. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 8 (10), 747-757 (1976).
- Yonenaga, K., et al. Optimal conditions of collagenase treatment for isolation of articular chondrocytes from aged human tissues. Regenerative Therapy. 6, 9-14 (2017).
- French, M. F., Mookhtiar, K. A., Van Wart, H. E. Limited proteolysis of type I collagen at hyperreactive sites by class I and II Clostridium histolyticum collagenases: complementary digestion patterns. Biochimie. 26 (3), 681-687 (1987).
- Hara, H., et al. In vitro investigation of pig cells for resistance to human antibody-mediated rejection. Transplant International: Official Journal of the European Society for Organ Transplantation. 21 (12), 1163-1174 (2008).
- Takashima, A. Establishment of fibroblast cultures. Current Protocols in Cell Biology. Chapter 2, 2.1.1-2.1.12 (2001).
