عزل وثقافة الخلايا البطانية الأبهرية الأولية من الخنازير المصغرة
Summary
يتم وصف طريقة أنزيمية فعالة لعزل الخلايا البطانية الأبهرية البورسينية الأولية (pAECs) من الخنازير المصغرة. يمكن استخدام pAECs الأولية المعزولة للتحقيق في الاستجابة المناعية والتخثر في الزرع xenotransplant.
Abstract
Xenotransplant هو وسيلة واعدة لحل النقص في الأعضاء البشرية للمرضى الذين يعانون من فشل الجهاز في المرحلة النهائية، ويعتبر الخنزير كمصدر مناسب للأعضاء. رفض المناعة والتخثر هما عقبتان رئيسيتان لنجاح زرع xenotransplant. إصابة الخلايا البطانية الوعائية (EC) والخلل مهم لتطوير استجابات الالتهاب والتخثر في زرع الأكسي. وهكذا، فإن عزل الخلايا البطانية الأبهرية البورسينية (pAECs) ضروري للتحقيق في استجابات الرفض المناعي والتخثر. هنا، قمنا بتطوير نهج أنزيمي بسيط لعزل وتوصيف وتوسيع pAECs عالية النقاء من الخنازير المصغرة. أولاً، تم التخدير عن الخنزير المصغر بالكيتامين، وتم استئصال طول الأبهر. ثانيا، تعرض السطح البطانية من الأبهر إلى 0.005٪ كولاجيناز الرابع محلول هضمي لمدة 15 دقيقة، ثالثا، تم كشط سطح بطانة الأبهر في اتجاه واحد فقط مع مكشطة الخلية (<10 مرات)، ولم يتم ضغطها خلال عملية الغاء. وأخيراً، تم تحديد pAECs معزولة من اليوم 3، وبعد مرور 1 والممر 2، عن طريق قياس التدفق مع الأجسام المضادة CD31. وكانت النسب المئوية للخلايا الإيجابية CD31 97.4٪ ± 1.2٪، 94.4٪ ± 1.1٪، و 92.4٪ ± 1.7٪ (يعني ± SD)، على التوالي. تركيز Collagenase الرابع، والوقت الهضمي، واتجاه، وتواتر وكثافة كشط حاسمة لخفض التلوث الليفي والحصول على عالية النقاء وعدد كبير من ECs. في الختام، لدينا طريقة الأنزيمية هي طريقة عالية الفعالية لعزل ECs من الأبهر الخنزير مصغرة، ويمكن توسيع الخلايا في المختبر للتحقيق في استجابات المناعة والتخثر في الزرع xenotransplant.
Introduction
نقص الأعضاء المتاحة للزرع هو مشكلة المعلقة في جميع أنحاء العالم1. ووفقا لجمعية الصليب الأحمر الصينية، لم يتلق سوى عدد قليل من المرضى الذين يعانون من فشل في الأعضاء في المرحلة النهائية جهازا مناسبا في الصين في عام 2018.
زرع Xenotransplant هو وسيلة واعدة لحل مشكلة نقص الأعضاء. وتعتبر أجهزة الخنزير لتكون الأجهزة الأكثر ملاءمة للبشر بسبب التشابه التشريحي والفيزيولوجي2،3. يرتبط فشل xenograft خنزير إلى حد كبير إلى رفض المناعة الرئيسيات والاستجابات التخثر. الخلايا البطانية البورسينية (ECs) حاسمة لأن هذه الخلايا هي الأولى للتفاعل مع الجهاز المناعي الرئيسي، والذي يتضمن الأجسام المضادة، تكملة، السيتوكينات، والخلايا المناعية (على سبيل المثال، الخلايا T، الخلايا B، والضامة)4،5. Porcine ECs تلعب دورا حيويا في عضو الخنزير وislet xenotransplant6,7. وهكذا، ECs هي خلايا هامة للتحقيق في ردود الرفض والتخثر لطعم الخنزير. مطلوب عزل عالية الجودة من الخنازير ECs لبحوث الزرع xenotransplant.
في محاولات لعزل ECs من أجهزة مختلفة (على سبيل المثال، القلب والكلى والكبد والأبهر)، تم الإبلاغ عن العديد من البروتوكولات في إعداد xenotransplant8،9،10،11،12. ومع ذلك، فإن الحفاظ على ثقافة فائقة النقاء للمركبات الإلكترونية المعزولة يمثل مشكلة بارزة في البروتوكولات القياسية. زيادة تركيز الحل المهضوم، ووقت الهضم غير المناسب وكثافة كشطقد تسهم في زيادة التلوث الليفي في الدراسات الحالية 8،10،13. إلى جانب ذلك، فإن طريقة pAECs معزولة من الخنازير مصغرة هو أقل دراسة. هنا، نقوم بوصف طريقة أنزيمية محسنة لعزل pAECs عالية النقاء من الخنازير المصغرة (Wuzhishan أو Bama). وقد تم تصميم عدة خطوات في البروتوكول للحد من التلوث الليفي والحصول على ECs عالية النقاء.
Protocol
Representative Results
Discussion
وتستخدم الخلايا البطانية عادة في البحوث من خلل الأوعية الدموية, مرض السكري, تجديد الأنسجة, زرع, والسرطانات14,15,16,17,18. لفهم وتوصيف البيولوجيا ووظيفة ECs في هذه الأمراض، تم الإبلاغ عن العديد من الطرق لعزل E…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم العمل بمنح من مؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة قوانغدونغ، منحة / جائزة رقم: 2016A030313028؛ مؤسسة البحوث العلمية الطبية في مقاطعة قوانغدونغ، منحة / جائزة رقم: B2018003؛ مؤسسة شنتشن للعلوم والتكنولوجيا، منحة / رقم الجائزة: JCYJ20180306172449376، JCYJ20180306172459580, JCJY20202920484975, GJHZ20170314171357556, JCYJ20160425103000011 و JCYJ201604288142040404045; شنتشن لونغهوا منطقة مؤسسة العلوم والتكنولوجيا، منحة / جائزة رقم: 2017013؛ البرنامج الوطني لمفاتيح R&D في الصين، منحة / جائزة رقم: 2017YFC1103704؛ مشروع سانمينغ للطب في شنتشن، منحة / جائزة رقم: SZSM201412020؛ صناديق خاصة لبناء مستشفيات عالية المستوى في مقاطعة قوانغدونغ (2019)؛ صندوق للانضباط الطبي العالي المستوى بناء شنتشن، منحة / جائزة رقم: 2016031638؛ مؤسسة شنتشن للصحة وتنظيم الأسرة لجنة، منحة / جائزة رقم: SZXJ2017021 وSZXJ2018059. نشكر هانتشنغ تشانغ وزيتشنغ زو من جامعة شنتشن على مساعدتهما فى اعداد المخطوطة .
Materials
| BD FACSAria II | BD Bioscience | ||
| Boneforceps | Beijing HeLi KeChuang Technology Development CO.,Ltd. China | HL-YGQ | |
| BOON Disposable Syringe (10ml) | Jiangsu Yile medical Article Co., Ltd. China | ||
| CD31-FITC antibody | Bio-Rad | MCA1746F | |
| Cell scraper | Corning | 3010# | |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138#-1G | |
| Compound ketamine injection | Veterinary Pharmaceutical Factory of Shenyang, China | Ketamine Hydrochloride：0.3g/2ml,Xylazine hydrochloride:0.3g/2ml, Phenacetin hydrochloride：1mg/2ml | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Life Technologies | D1306# | |
| DMEM | Life Technologies | 11965118# | |
| ECM | Sciencell | 1001# | |
| ECGS | Sciencell | 1052# | |
| Eppendorf Snap-Cap Microtube(1.5mL) | AXYGEN | MCT-150-C# | |
| Falcon 100mm Cell Culture Dish | Corning | 353003# | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | 10270-106# | |
| Flowjo v10.0 | |||
| Forceps | ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China | ||
| Heparin sodium | Jiangsu WanBang biopharmaceutical Co.,Ltd.China | ||
| Iodine tincture | Guilin LiFeng Medical Supplies Co.,Ltd.China | ||
| Miniature Pig (Bama or Wuzhishan) | Kang Yi Ecological Agriculture Co., Ltd, China | ||
| Mshot microscope | Guangzhou Micro-shot Technology Co., Ltd. | M152 | |
| Petri Dishes (150 x 15 mm) | Biologixgroup | 66-1515# | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070063# | |
| Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Vent Cap （T25） | Corning | 3289# | |
| Scissors | ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China | ||
| Serological Transfer Pipettes (10ml) | JET Biofil | GSP010010# | |
| Sterile Pasteur Pipette | GeneBrick | GY0025# | |
| Sterile Syringe Filter (0.22µm) | Millipore | SLGV033RS# | |
| Surgical scalpel | ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China | 22# | |
| Surgical suture | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., Ltd | 5-0# | |
| Syringe（5mL） | Shengguang Medical Instrument Co., Ltd.China | ||
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | GIBCO | 25200056# | |
| 75% Medical alcohol | Guilin LiFeng Medical Supplies Co.,Ltd.China | ||
| 20 x PBS solution (pH 7.4,Nuclease free) | Sangon Biotech | B540627# | |
| Medical disinfectant 84 liquid | Sichuan Province Yijieshi Medical Technology Co., Ltd | 450ml/bottle |
References
- Zhang, G. Y., Liao, T., Fu, X. B., Li, Q. F. Organ transplantation in China: concerns remain. Lancet. 385 (9971), 854-855 (2015).
- Ekser, B., et al. Clinical xenotransplantation: the next medical revolution?. Lancet. 379 (9816), 672-683 (2012).
- Cooper, D. K., Ekser, B., Ramsoondar, J., Phelps, C., Ayares, D. The role of genetically engineered pigs in xenotransplantation research. The Journal of Pathology. 238 (2), 288-299 (2016).
- Pober, J. S., Sessa, W. C. Evolving functions of endothelial cells in inflammation. Nature Reviews Immunology. 7 (10), 803-815 (2007).
- McGill, S. N., Ahmed, N. A., Christou, N. V. Endothelial cells: role in infection and inflammation. World Journal of Surgery. 22 (2), 171-178 (1998).
- Ekser, B., Cooper, D. K. Overcoming the barriers to xenotransplantation: prospects for the future. Expert Review of Clinical Immunology. 6 (2), 219-230 (2010).
- Yeom, H. J., et al. Porcine aortic endothelial cell genes responsive to selected inflammatory stimulators. The Journal of Veterinary Medical Science. 71 (11), 1499-1508 (2009).
- Beigi, F., et al. Optimized method for isolating highly purified and functional porcine aortic endothelial and smooth muscle cells. Journal of Cellular Physiology. 232 (11), 3139-3145 (2017).
- Jansen of Lorkeers, S. J., et al. Xenotransplantation of Human Cardiomyocyte Progenitor Cells Does Not Improve Cardiac Function in a Porcine Model of Chronic Ischemic Heart Failure. Results from a Randomized, Blinded, Placebo Controlled Trial. PLOS One. 10 (12), e0143953 (2015).
- Zhang, J., et al. Potential Antigens Involved in Delayed Xenograft Rejection in a Ggta1/Cmah Dko Pig-to-Monkey Model. Scientific Reports. 7 (1), 10024 (2017).
- Paris, L. L., et al. ASGR1 expressed by porcine enriched liver sinusoidal endothelial cells mediates human platelet phagocytosis in vitro. Xenotransplantation. 18 (4), 245-251 (2011).
- Paris, L. L., Chihara, R. K., Sidner, R. A., Tector, A. J., Burlak, C. Differences in human and porcine platelet oligosaccharides may influence phagocytosis by liver sinusoidal cells in vitro. Xenotransplantation. 19 (1), 31-39 (2012).
- Bernardini, C., et al. Heat shock protein 70, heat shock protein 32, and vascular endothelial growth factor production and their effects on lipopolysaccharide-induced apoptosis in porcine aortic endothelial cells. Cell Stress & Chaperones. 10 (4), 340-348 (2005).
- Endemann, D. H., Schiffrin, E. L. Endothelial dysfunction. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 15 (8), 1983-1992 (2004).
- Graupera, M., Claret, M. Endothelial Cells: New Players in Obesity and Related Metabolic Disorders. Trends in Endocrinology and Metabolism: TEM. 29 (11), 781-794 (2018).
- Kawamoto, A., Asahara, T., Losordo, D. W. Transplantation of endothelial progenitor cells for therapeutic neovascularization. Cardiovascular Radiation Medicine. 3 (3-4), 221-225 (2002).
- Rafii, S., Lyden, D. Therapeutic stem and progenitor cell transplantation for organ vascularization and regeneration. Nature Medicine. 9 (6), 702-712 (2003).
- Jain, R. K., et al. Endothelial cell death, angiogenesis, and microvascular function after castration in an androgen-dependent tumor: role of vascular endothelial growth factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (18), 10820-10825 (1998).
- Pratumvinit, B., Reesukumal, K., Janebodin, K., Ieronimakis, N., Reyes, M. Isolation, characterization, and transplantation of cardiac endothelial cells. BioMed Research International. 2013, 359412 (2013).
- Crouch, E. E., Doetsch, F. FACS isolation of endothelial cells and pericytes from mouse brain microregions. Nature Protocols. 13 (4), 738-751 (2018).
- Nakano, H., Nakano, K., Cook, D. N. Isolation and Purification of Epithelial and Endothelial Cells from Mouse Lung. Methods in Molecular Biology. 1799, 59-69 (2018).
- Naschberger, E., et al. Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma – An Improved Protocol. Journal of Visualized Experiments. (134), e57400 (2018).
- Yu, S., et al. Isolation and characterization of endothelial colony-forming cells from mononuclear cells of rat bone marrow. Experimental Cell Research. 370 (1), 116-126 (2018).
- Chi, L., Delgado-Olguin, P. Isolation and Culture of Mouse Placental Endothelial Cells. Methods in Molecular Biology. 1752, 101-109 (2018).
- Hawthorne, W. J., Lew, A. M., Thomas, H. E. Genetic strategies to bring islet xenotransplantation to the clinic. Current Opinion in Organ Transplantation. 21 (5), 476-483 (2016).
- Yi, E., et al. Mechanical Forces Accelerate Collagen Digestion by Bacterial Collagenase in Lung Tissue Strips. Frontiers in Physiology. 7, 287 (2016).
- Masson-Pevet, M., Jongsma, H. J., De Bruijne, J. Collagenase- and trypsin-dissociated heart cells: a comparative ultrastructural study. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 8 (10), 747-757 (1976).
- Yonenaga, K., et al. Optimal conditions of collagenase treatment for isolation of articular chondrocytes from aged human tissues. Regenerative Therapy. 6, 9-14 (2017).
- French, M. F., Mookhtiar, K. A., Van Wart, H. E. Limited proteolysis of type I collagen at hyperreactive sites by class I and II Clostridium histolyticum collagenases: complementary digestion patterns. Biochimie. 26 (3), 681-687 (1987).
- Hara, H., et al. In vitro investigation of pig cells for resistance to human antibody-mediated rejection. Transplant International: Official Journal of the European Society for Organ Transplantation. 21 (12), 1163-1174 (2008).
- Takashima, A. Establishment of fibroblast cultures. Current Protocols in Cell Biology. Chapter 2, 2.1.1-2.1.12 (2001).
