Isolement et culture des cellules endothéliales aortiques primaires des porcs miniatures
Summary
Une méthode enzymatique efficace pour l’isolement des cellules endothéliales aortiques primaires porcines (pAECs) des porcs miniatures est décrite. Les pAECs primaires isolés peuvent être employés pour étudier la réponse immunisée et de coagulation dans la xénotransplantation.
Abstract
La xénotransplantation est un moyen prometteur de résoudre la pénurie d’organes humains chez les patients atteints d’insuffisance d’organes en phase finale, et le porc est considéré comme une source d’organes appropriée. Le rejet immunitaire et la coagulation sont deux obstacles majeurs au succès de la xénotransplantation. Les dommages et le dysfonctionnement vasculaires de cellules endothéliales (EC) sont importants pour le développement des réponses d’inflammation et de coagulation dans la xénotransplantation. Ainsi, l’isolement des cellules endothéliales aortiques porcines (pAECs) est nécessaire pour étudier les réponses de rejet et de coagulation immunisées. Ici, nous avons développé une approche enzymatique simple pour l’isolement, la caractérisation et l’expansion des pAEC sépulifiés à partir de porcs miniatures. Tout d’abord, le cochon miniature a été anesthésié avec de la kétamine, et une longueur d’aorte a été excisée. Deuxièmement, la surface endothéliale de l’aorte a été exposée à une solution digestive de collagène IV de 0,005 % pendant 15 min. Troisièmement, la surface endothéliale de l’aorte a été grattée dans une seule direction avec un grattoir cellulaire (10 fois) et n’a pas été comprimée au cours du processus de raclement. Enfin, les pAECs isolés du jour 3, et après passage 1 et passage 2, ont été identifiés par cytométrie de flux avec un anticorps anti-CD31. Les pourcentages de cellules CD31-positives étaient de 97,4 % – 1,2 %, 94,4 % – 1,1 %, et 92,4 % – 1,7 % (moyenne et DD), respectivement. La concentration de Collagène IV, le temps digestif, la direction, la fréquence et l’intensité du raclage sont essentiels pour diminuer la contamination par le fibroblaste et obtenir une haute pureté et un grand nombre d’ECs. En conclusion, notre méthode enzymatique est une méthode très effctive pour isoler les ECs de l’aorte miniature de porc, et les cellules peuvent être étendues in vitro pour étudier les réponses immunitaires et de coagulation dans la xénotransplantation.
Introduction
La pénurie d’organes disponibles pour la transplantation est un problème en suspens dans le monde entier1. Selon la Croix-Rouge chinoise, seul un petit nombre de patients atteints d’insuffisance d’organes en phase finale ont reçu un organe approprié en Chine en 2018.
La xénotransplantation est un moyen prometteur de résoudre le problème de la pénurie d’organes. Les organes porcins sont considérés comme les organes les plus appropriés pour l’homme en raison de similitudes anatomiques et physiologiques2,3. L’échec d’un xénogreffe de porc est en grande partie lié au rejet immunitaire de primate et aux réponses de coagulation. Les cellules endothéliales porcines (EC) sont critiques puisque ces cellules sont les premières à interagir avec le système immunitaire des primates, qui comprend des anticorps, des compléments, des cytokines et des cellules immunitaires (p. ex. lymphocytes T, cellules B et macrophages)4,5. Les CE porcins jouent un rôle vital dans l’organe porcin et la xénotransplantation des îlots6,7. Ainsi, les EC sont des cellules importantes pour étudier les réponses de rejet et de coagulation à une greffe de porc. L’isolement des EC soudeurs porcins de haute qualité est nécessaire pour la recherche sur la xénotransplantation.
Dans les tentatives d’isoler les EC de différents organes (p. ex. cœur, rein, foie et aorte), plusieurs protocoles ont été signalés dans un cadre de xénotransplantation8,9,10,11,12. Cependant, le maintien d’une culture ultrapure d’ECs isolés est un problème exceptionnel dans les protocoles standard. La concentration accrue de la solution digérée, le temps de digestion inapproprié et l’intensité des éraflures peuvent contribuer à l’augmentation de la contamination par le fibroblaste dans les études actuelles8,10,13. En outre, la méthode des pAECs isolés de porcs miniatures est moins étudiée. Ici, nous décrivons une méthode enzymatique optimisée pour isoler les pAECs fortement purifiés des porcs miniatures (Wuzhishan ou Bama). Plusieurs étapes du protocole ont été conçues pour réduire la contamination par le fibroblaste et obtenir des EC de haute pureté.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les cellules endothéliales sont couramment utilisées dans la recherche sur le dysfonctionnement vasculaire, le diabète, la régénération des tissus, la transplantation et les cancers14,15,16,17,18. Pour comprendre et caractériser la biologie et la fonction des E dans ces maladies, de nombreuses méthodes d’isolement des CE de différents organes ou tissu…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les travaux ont été soutenus par des subventions de la Natural Science Foundation of Guangdong Province, Numéro de subvention/prix: 2016A030313028; Medical Scientific Research Foundation of Guangdong Province, Grant/Award Number: B2018003; Shenzhen Foundation of Science and Technology, Numéro de subvention/prix: JCYJ20180306172449376, JCYJ20180306172459580, JCJY20160222204849975, GJHZ2017031417135556, JCYJ201604251030000011 et JCYJ2016042420420 Shenzhen Longhua District Foundation of Science and Technology, Numéro de subvention/prix: 2017013; National Key R-D Program of China, Grant/Award Number: 2017YFC1103704; Sanming Project of Medicine à Shenzhen, Numéro de subvention/prix: SZSM201412020; Fonds spéciaux pour la construction d’hôpitaux de haut niveau dans la province du Guangdong (2019); Fonds pour la construction de discipline médicale de haut niveau de Shenzhen, numéro de subvention/prix : 2016031638 ; Shenzhen Foundation of Health and Family Planning Commission, Numéro de subvention/prix: SZXJ2017021 et SZXJ2018059. Nous remercions Hancheng Zhang et Zhicheng Zou de l’Université de Shenzhen d’avoir aidé à la préparation du manuscrit.
Materials
| BD FACSAria II | BD Bioscience | ||
| Boneforceps | Beijing HeLi KeChuang Technology Development CO.,Ltd. China | HL-YGQ | |
| BOON Disposable Syringe (10ml) | Jiangsu Yile medical Article Co., Ltd. China | ||
| CD31-FITC antibody | Bio-Rad | MCA1746F | |
| Cell scraper | Corning | 3010# | |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138#-1G | |
| Compound ketamine injection | Veterinary Pharmaceutical Factory of Shenyang, China | Ketamine Hydrochloride：0.3g/2ml,Xylazine hydrochloride:0.3g/2ml, Phenacetin hydrochloride：1mg/2ml | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Life Technologies | D1306# | |
| DMEM | Life Technologies | 11965118# | |
| ECM | Sciencell | 1001# | |
| ECGS | Sciencell | 1052# | |
| Eppendorf Snap-Cap Microtube(1.5mL) | AXYGEN | MCT-150-C# | |
| Falcon 100mm Cell Culture Dish | Corning | 353003# | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | 10270-106# | |
| Flowjo v10.0 | |||
| Forceps | ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China | ||
| Heparin sodium | Jiangsu WanBang biopharmaceutical Co.,Ltd.China | ||
| Iodine tincture | Guilin LiFeng Medical Supplies Co.,Ltd.China | ||
| Miniature Pig (Bama or Wuzhishan) | Kang Yi Ecological Agriculture Co., Ltd, China | ||
| Mshot microscope | Guangzhou Micro-shot Technology Co., Ltd. | M152 | |
| Petri Dishes (150 x 15 mm) | Biologixgroup | 66-1515# | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070063# | |
| Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Vent Cap （T25） | Corning | 3289# | |
| Scissors | ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China | ||
| Serological Transfer Pipettes (10ml) | JET Biofil | GSP010010# | |
| Sterile Pasteur Pipette | GeneBrick | GY0025# | |
| Sterile Syringe Filter (0.22µm) | Millipore | SLGV033RS# | |
| Surgical scalpel | ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China | 22# | |
| Surgical suture | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., Ltd | 5-0# | |
| Syringe（5mL） | Shengguang Medical Instrument Co., Ltd.China | ||
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | GIBCO | 25200056# | |
| 75% Medical alcohol | Guilin LiFeng Medical Supplies Co.,Ltd.China | ||
| 20 x PBS solution (pH 7.4,Nuclease free) | Sangon Biotech | B540627# | |
| Medical disinfectant 84 liquid | Sichuan Province Yijieshi Medical Technology Co., Ltd | 450ml/bottle |
References
- Zhang, G. Y., Liao, T., Fu, X. B., Li, Q. F. Organ transplantation in China: concerns remain. Lancet. 385 (9971), 854-855 (2015).
- Ekser, B., et al. Clinical xenotransplantation: the next medical revolution?. Lancet. 379 (9816), 672-683 (2012).
- Cooper, D. K., Ekser, B., Ramsoondar, J., Phelps, C., Ayares, D. The role of genetically engineered pigs in xenotransplantation research. The Journal of Pathology. 238 (2), 288-299 (2016).
- Pober, J. S., Sessa, W. C. Evolving functions of endothelial cells in inflammation. Nature Reviews Immunology. 7 (10), 803-815 (2007).
- McGill, S. N., Ahmed, N. A., Christou, N. V. Endothelial cells: role in infection and inflammation. World Journal of Surgery. 22 (2), 171-178 (1998).
- Ekser, B., Cooper, D. K. Overcoming the barriers to xenotransplantation: prospects for the future. Expert Review of Clinical Immunology. 6 (2), 219-230 (2010).
- Yeom, H. J., et al. Porcine aortic endothelial cell genes responsive to selected inflammatory stimulators. The Journal of Veterinary Medical Science. 71 (11), 1499-1508 (2009).
- Beigi, F., et al. Optimized method for isolating highly purified and functional porcine aortic endothelial and smooth muscle cells. Journal of Cellular Physiology. 232 (11), 3139-3145 (2017).
- Jansen of Lorkeers, S. J., et al. Xenotransplantation of Human Cardiomyocyte Progenitor Cells Does Not Improve Cardiac Function in a Porcine Model of Chronic Ischemic Heart Failure. Results from a Randomized, Blinded, Placebo Controlled Trial. PLOS One. 10 (12), e0143953 (2015).
- Zhang, J., et al. Potential Antigens Involved in Delayed Xenograft Rejection in a Ggta1/Cmah Dko Pig-to-Monkey Model. Scientific Reports. 7 (1), 10024 (2017).
- Paris, L. L., et al. ASGR1 expressed by porcine enriched liver sinusoidal endothelial cells mediates human platelet phagocytosis in vitro. Xenotransplantation. 18 (4), 245-251 (2011).
- Paris, L. L., Chihara, R. K., Sidner, R. A., Tector, A. J., Burlak, C. Differences in human and porcine platelet oligosaccharides may influence phagocytosis by liver sinusoidal cells in vitro. Xenotransplantation. 19 (1), 31-39 (2012).
- Bernardini, C., et al. Heat shock protein 70, heat shock protein 32, and vascular endothelial growth factor production and their effects on lipopolysaccharide-induced apoptosis in porcine aortic endothelial cells. Cell Stress & Chaperones. 10 (4), 340-348 (2005).
- Endemann, D. H., Schiffrin, E. L. Endothelial dysfunction. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 15 (8), 1983-1992 (2004).
- Graupera, M., Claret, M. Endothelial Cells: New Players in Obesity and Related Metabolic Disorders. Trends in Endocrinology and Metabolism: TEM. 29 (11), 781-794 (2018).
- Kawamoto, A., Asahara, T., Losordo, D. W. Transplantation of endothelial progenitor cells for therapeutic neovascularization. Cardiovascular Radiation Medicine. 3 (3-4), 221-225 (2002).
- Rafii, S., Lyden, D. Therapeutic stem and progenitor cell transplantation for organ vascularization and regeneration. Nature Medicine. 9 (6), 702-712 (2003).
- Jain, R. K., et al. Endothelial cell death, angiogenesis, and microvascular function after castration in an androgen-dependent tumor: role of vascular endothelial growth factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (18), 10820-10825 (1998).
- Pratumvinit, B., Reesukumal, K., Janebodin, K., Ieronimakis, N., Reyes, M. Isolation, characterization, and transplantation of cardiac endothelial cells. BioMed Research International. 2013, 359412 (2013).
- Crouch, E. E., Doetsch, F. FACS isolation of endothelial cells and pericytes from mouse brain microregions. Nature Protocols. 13 (4), 738-751 (2018).
- Nakano, H., Nakano, K., Cook, D. N. Isolation and Purification of Epithelial and Endothelial Cells from Mouse Lung. Methods in Molecular Biology. 1799, 59-69 (2018).
- Naschberger, E., et al. Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma – An Improved Protocol. Journal of Visualized Experiments. (134), e57400 (2018).
- Yu, S., et al. Isolation and characterization of endothelial colony-forming cells from mononuclear cells of rat bone marrow. Experimental Cell Research. 370 (1), 116-126 (2018).
- Chi, L., Delgado-Olguin, P. Isolation and Culture of Mouse Placental Endothelial Cells. Methods in Molecular Biology. 1752, 101-109 (2018).
- Hawthorne, W. J., Lew, A. M., Thomas, H. E. Genetic strategies to bring islet xenotransplantation to the clinic. Current Opinion in Organ Transplantation. 21 (5), 476-483 (2016).
- Yi, E., et al. Mechanical Forces Accelerate Collagen Digestion by Bacterial Collagenase in Lung Tissue Strips. Frontiers in Physiology. 7, 287 (2016).
- Masson-Pevet, M., Jongsma, H. J., De Bruijne, J. Collagenase- and trypsin-dissociated heart cells: a comparative ultrastructural study. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 8 (10), 747-757 (1976).
- Yonenaga, K., et al. Optimal conditions of collagenase treatment for isolation of articular chondrocytes from aged human tissues. Regenerative Therapy. 6, 9-14 (2017).
- French, M. F., Mookhtiar, K. A., Van Wart, H. E. Limited proteolysis of type I collagen at hyperreactive sites by class I and II Clostridium histolyticum collagenases: complementary digestion patterns. Biochimie. 26 (3), 681-687 (1987).
- Hara, H., et al. In vitro investigation of pig cells for resistance to human antibody-mediated rejection. Transplant International: Official Journal of the European Society for Organ Transplantation. 21 (12), 1163-1174 (2008).
- Takashima, A. Establishment of fibroblast cultures. Current Protocols in Cell Biology. Chapter 2, 2.1.1-2.1.12 (2001).
