Isolation und Kultur der primären Aorten-Endothelzellen von Miniaturschweinen
Summary
Beschrieben wird eine wirksame enzymatische Methode zur Isolierung von primären porcineaortischen Endothelzellen (pAECs) von Miniaturschweinen. Die isolierten primären pAECs können verwendet werden, um die Immun- und Gerinnungsreaktion bei Xenotransplantation zu untersuchen.
Abstract
Xenotransplantation ist ein vielversprechender Weg, um den Mangel an menschlichen Organen für Patienten mit Organversagen im Endstadium zu beheben, und das Schwein gilt als geeignete Organquelle. Immunabstoßung und Gerinnung sind zwei große Hürden für den Erfolg der Xenotransplantation. Vaskuläre Endothelzell (EC) Verletzungen und Dysfunktion sind wichtig für die Entwicklung der Entzündung und Gerinnungsreaktionen bei Xenotransplantation. Daher ist die Isolierung von Porenaorten-Endothelzellen (pAECs) notwendig, um die Immunabstoßung und Gerinnungsreaktionen zu untersuchen. Hier haben wir einen einfachen enzymatischen Ansatz für die Isolierung, Charakterisierung und Erweiterung hochgereinigter pAECs von Miniaturschweinen entwickelt. Zuerst wurde das Miniaturschwein mit Ketamin beästheisiert, und eine Länge von Aorta wurde ausgeschnitten. Zweitens wurde die endotheliale Oberfläche der Aorta 15 min der Kollagenase IV-Verdauungslösung ausgesetzt. Drittens wurde die endotheliale Oberfläche der Aorta in nur einer Richtung mit einem Zellschaber (<10-mal) abgekratzt und während des Prozesses der Kratzen. Schließlich wurden die isolierten pAECs von Tag 3 und nach Durchgang 1 und Durchgang 2 durch Durchflusszytometrie mit einem Anti-CD31-Antikörper identifiziert. Die Prozentsätze der CD31-positiven Zellen betrugen 97,4 % bei 1,2 %, 94,4 % bei 1,1 % bzw. 92,4 % bei 1,7 % (mittlere SD). Die Konzentration von Kollagenase IV, die Verdauungszeit, die Richtung, die Häufigkeit und Intensität des Abkratzens sind entscheidend für die Verringerung der Fibroblastenkontamination und die Erlangung einer hohen Reinheit und einer großen Anzahl von ECs. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass unsere enzymatische Methode eine hochwirksame Methode zur Isolierung von ECs aus der Miniatur-Schweineaorta ist, und die Zellen können in vitro erweitert werden, um die Immun- und Gerinnungsreaktionen bei der Xenotransplantation zu untersuchen.
Introduction
Der Mangel an verfügbaren Organen für die Transplantation ist weltweit ein offenes Problem1. Nach Angaben der Rotkreuz-Gesellschaft Chinas erhielt 2018 nur eine kleine Anzahl von Patienten mit Organversagen im Endstadium ein geeignetes Organ in China.
Xenotransplantation ist ein vielversprechender Weg, um das Problem des Organmangels zu lösen. Schweineorgane gelten aufgrund anatomischer und physiologischer Ähnlichkeiten als die am besten geeigneten Organe für den Menschen2,3. Das Versagen eines Schweinexenografts hängt weitgehend mit der Immunabstoßung und Gerinnungsreaktionen des Primaten zusammen. Porcine Endothelzellen (ECs) sind kritisch, da diese Zellen die ersten sind, die mit dem Primaten-Immunsystem interagieren, das Antikörper, Komplement, Zytokine und Immunzellen (z. B. T-Zellen, B-Zellen und Makrophagen)4,5umfasst. Schweine-ECs spielen eine wichtige Rolle in Schweineorgan und Islet Xenotransplantation6,7. Daher sind ECs wichtige Zellen für die Untersuchung der Abstoßungs- und Gerinnungsreaktionen auf ein Schweinetransplantat. Für die Xenotransplantationsforschung ist die Isolierung hochwertiger Schweine-ECs erforderlich.
Bei Versuchen, ECs aus verschiedenen Organen (z.B. Herz, Niere, Leber und Aorta) zu isolieren, wurden mehrere Protokolle in einer Xenotransplantateinstellung8,9,10,11,12berichtet. Die Beibehaltung einer ultrareinen Kultur isolierter ECs ist jedoch ein herausragendes Problem in Standardprotokollen. Die erhöhte Konzentration der verdauten Lösung, ungeeignete Verdauungszeit und Kratzintensität können zur erhöhten Fibroblastenkontamination in aktuellen Studien8,10,13beitragen. Außerdem wird die Methode der isolierten pAECs von Miniaturschweinen weniger untersucht. Hier beschreiben wir eine optimierte enzymatische Methode zur Isolierung hochgereinigter pAECs von Miniaturschweinen (Wuzhishan oder Bama). Mehrere Schritte des Protokolls wurden entwickelt, um die Fibroblastenkontamination zu reduzieren und hochreine ECs zu erhalten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Endothelzellen werden häufig in der Forschung von vaskulären Dysfunktion, Diabetes, Geweberegeneration, Transplantation, und Krebs14,15,16,17,18verwendet. Um die Biologie und Funktion von ECs bei diesen Krankheiten zu verstehen und zu charakterisieren, wurden zahlreiche Methoden zur Isolierung der ECs verschiedener erkrankter Organe oder Gewebe berichtet<sup…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Arbeit wurde durch Stipendien der Natural Science Foundation der Provinz Guangdong, Grant/Award Nummer: 2016A030313028; Medical Scientific Research Foundation of Guangdong Province, Grant/Award Number: B2018003; Shenzhen Foundation of Science and Technology, Grant/Award-Nummer: JCYJ20180306172449376, JCYJ20180306172459580, JCJY20160229204849975, GJHZ20170314171357556, JCYJ20160425103000011 und JCYJ201604281420404945; Shenzhen Longhua District Foundation of Science and Technology, Grant/Award Number: 2017013; National Key R&D Programm von China, Grant/Award-Nummer: 2017YFC1103704; Sanming Project of Medicine in Shenzhen, Grant/Award Number: SZSM201412020; Sonderfonds für den Bau hochrangiger Krankenhäuser in der Provinz Guangdong (2019); Fund for High Level Medical Discipline Construction of Shenzhen, Grant/Award Number: 2016031638; Shenzhen Foundation of Health and Family Planning Commission, Grant/Award Number: SZXJ2017021 und SZXJ2018059. Wir danken Hancheng Zhang und Zhicheng Zou von der Universität Shenzhen für die Unterstützung bei der Erstellung des Manuskripts.
Materials
| BD FACSAria II | BD Bioscience | ||
| Boneforceps | Beijing HeLi KeChuang Technology Development CO.,Ltd. China | HL-YGQ | |
| BOON Disposable Syringe (10ml) | Jiangsu Yile medical Article Co., Ltd. China | ||
| CD31-FITC antibody | Bio-Rad | MCA1746F | |
| Cell scraper | Corning | 3010# | |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138#-1G | |
| Compound ketamine injection | Veterinary Pharmaceutical Factory of Shenyang, China | Ketamine Hydrochloride：0.3g/2ml,Xylazine hydrochloride:0.3g/2ml, Phenacetin hydrochloride：1mg/2ml | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Life Technologies | D1306# | |
| DMEM | Life Technologies | 11965118# | |
| ECM | Sciencell | 1001# | |
| ECGS | Sciencell | 1052# | |
| Eppendorf Snap-Cap Microtube(1.5mL) | AXYGEN | MCT-150-C# | |
| Falcon 100mm Cell Culture Dish | Corning | 353003# | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | 10270-106# | |
| Flowjo v10.0 | |||
| Forceps | ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China | ||
| Heparin sodium | Jiangsu WanBang biopharmaceutical Co.,Ltd.China | ||
| Iodine tincture | Guilin LiFeng Medical Supplies Co.,Ltd.China | ||
| Miniature Pig (Bama or Wuzhishan) | Kang Yi Ecological Agriculture Co., Ltd, China | ||
| Mshot microscope | Guangzhou Micro-shot Technology Co., Ltd. | M152 | |
| Petri Dishes (150 x 15 mm) | Biologixgroup | 66-1515# | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070063# | |
| Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Vent Cap （T25） | Corning | 3289# | |
| Scissors | ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China | ||
| Serological Transfer Pipettes (10ml) | JET Biofil | GSP010010# | |
| Sterile Pasteur Pipette | GeneBrick | GY0025# | |
| Sterile Syringe Filter (0.22µm) | Millipore | SLGV033RS# | |
| Surgical scalpel | ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China | 22# | |
| Surgical suture | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., Ltd | 5-0# | |
| Syringe（5mL） | Shengguang Medical Instrument Co., Ltd.China | ||
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | GIBCO | 25200056# | |
| 75% Medical alcohol | Guilin LiFeng Medical Supplies Co.,Ltd.China | ||
| 20 x PBS solution (pH 7.4,Nuclease free) | Sangon Biotech | B540627# | |
| Medical disinfectant 84 liquid | Sichuan Province Yijieshi Medical Technology Co., Ltd | 450ml/bottle |
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