소형 돼지에서 1 차 대동맥 내피 세포의 격리 및 배양
Summary
소형 돼지로부터 1차 돼지 대동맥 내피 세포(pAECs)를 분리하는 효과적인 효소 방법이 설명되어 있다. 단리된 1차 pAECs는 이종이식에서 면역 및 응고 반응을 조사하는데 사용될 수 있다.
Abstract
Xenotransplantation은 말기 장기 부전 환자를 위한 인간 기관의 부족을 해결하는 유망한 방법이고, 돼지는 적당한 기관 근원으로 여겨됩니다. 면역 거부 및 응고는 이종이식의 성공을 위한 2개의 중요한 장애물입니다. 혈관 내피 세포 (EC) 손상 및 기능 장애는 이종이식에서 염증 및 응고 반응의 발달에 중요하다. 따라서, 돼지 대동맥 내피 세포(pAECs)의 분리는 면역 거부 반응 및 응고 반응을 조사하기 위해 필요하다. 여기에서, 우리는 소형 돼지에서 고도로 정제된 pAE의 격리, 특성화 및 확장을 위한 간단한 효소 접근법을 개발했습니다. 첫째, 미니어처 돼지는 케타민으로 마취되었고, 대공의 길이를 절제시켰다. 둘째, 대치의 내피 표면은 0.005 % 콜라게나아제 IV 소화액에 15 분 동안 노출되었습니다. 셋째, 대초원의 내피 표면은 세포 스크레이퍼 (<10 회)로 한 방향으로만 긁어 내고 (<10 번), 및 의 과정에서 압축되지 않았습니다. 긁. 마지막으로, 제3일의 단리된 pAECs, 및 제1및 2항 후에, 항-CD31 항체를 가진 유세포측정에 의해 확인되었다. CD31 양성 세포의 백분율은 각각 97.4% ±1.2%, 94.4% ±1.1%, 및 92.4% ±1.7%(평균 ±SD)였다. 콜라게나아제 IV의 농도, 소화 시간, 방향, 스크레이핑의 빈도 및 강도는 섬유아세포 오염을 줄이고 고순도 및 많은 수의 EC를 얻는 데 매우 중요합니다. 결론적으로, 우리의 효소 방법은 소형 돼지 대원으로부터 EC를 분리하는 고효율 방법이며, 세포는 이종이식에서 면역 및 응고 반응을 조사하기 위해 시험관 내에서 확장 될 수 있습니다.
Introduction
이식에 사용할 수 있는 장기의 부족은 전세계적으로 눈에 띄는 문제 1. 중국 적십자사에 따르면, 2018년 중국에서 말기 장기 부전 환자 중 소수의 환자만이 적합한 장기를 받았다고 합니다.
Xenotransplantation은 장기 부족 문제를 해결할 수있는 유망한 방법입니다. 돼지 장기는 해부학및 생리적 유사성 때문에 인간에게 가장 적합한기관으로 간주되며 2,3. 돼지 이종이식의 실패는 주로 영장류 면역 거부 및 응고 반응과 관련이 있다. 돼지 내피 세포(ECs)는 이들 세포가 항체, 보체, 사이토카인 및 면역 세포(예를 들어, T 세포, B 세포 및 대식세포)를 포함하는 영장류 면역계와 상호 작용하는 첫 번째 세포이기 때문에 중요하다 4,5. 돼지 장기와 아일렛 이종이식6,7에서중요한 역할을 하는 돼지 ECs. 따라서, ECs는 돼지 이식편에 대한 거부 및 응고 반응을 조사하기 위한 중요한 세포이다. 이종이식 연구에는 고품질 돼지 EC의 분리가 필요합니다.
상이한 장기(예를 들어, 심장, 신장, 간 및 대류)로부터 EC를 분리하려는 시도에서, 여러 프로토콜은8, 9,10,11,12를 이종이식으로 보고되었다. 그러나 격리된 EC의 초순수 문화를 유지하는 것은 표준 프로토콜에서 뛰어난 문제입니다. 소화 된 용액의 농도 증가, 부적절한 소화 시간 및 긁힘 강도는 현재연구에서섬유 아세포 오염 증가8,10,13에기여할 수 있습니다. 게다가, 소형 돼지에서 분리 된 pAECs의 방법은 덜 연구된다. 여기서, 우리는 소형 돼지 (우지산 또는 바마)에서 고도로 정제 된 pAECs를 분리하는 최적화 된 효소 방법을 설명합니다. 프로토콜의 여러 단계는 섬유아세포 오염을 줄이고 고순도 EC를 얻기 위해 고안되었습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
내피 세포는 혈관 기능 장애, 당뇨병, 조직 재생, 이식 및 암14,15,16,17,18의연구에 일반적으로 사용된다. 이러한 질병에서 EC의 생물학 및 기능을 이해하고 특성화하기 위해, 다른 병든 장기 또는 조직의 EC를 분리하는 수많은 방법이8,19,</…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 광동성 자연 과학 재단의 보조금에 의해 지원되었다, 보조금 / 수상 번호: 2016A030313028; 광동성 의학 과학 연구 재단, 보조금 / 수상 번호: B2018003; 심천 과학 기술 재단, 그랜트 / 수상 번호: JCYJ20180306172449376, JCYJ20180306172459580, JCJY202022229204449975, GJHZ2022920449975, GJHZ20170331417135556, JCYJ20201604011 및 JCYJ2016040440404040 심천 롱화 지구 과학 기술 재단, 보조금 / 수상 번호: 2017013; 중국 의 국가 주요 R & D 프로그램, 보조금 / 수상 번호: 2017YFC1103704; 심천에서 의학의 산밍 프로젝트, 그랜트 / 수상 번호: SZSM201412020; 광동성 고등병원 건립특별기금(2019년) 심천의 높은 수준의 의료 분야 건설을위한 기금, 보조금 / 수상 번호: 2016031638; 심천 건강 및 가족 계획 위원회의 재단, 보조금 / 수상 번호 : SZXJ2017021 및 SZXJ2018059. 우리는 원고의 준비를 도와 준 심천 대학에서 한청 장과 Zhicheng Zou 감사합니다.
Materials
| BD FACSAria II | BD Bioscience | ||
| Boneforceps | Beijing HeLi KeChuang Technology Development CO.,Ltd. China | HL-YGQ | |
| BOON Disposable Syringe (10ml) | Jiangsu Yile medical Article Co., Ltd. China | ||
| CD31-FITC antibody | Bio-Rad | MCA1746F | |
| Cell scraper | Corning | 3010# | |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138#-1G | |
| Compound ketamine injection | Veterinary Pharmaceutical Factory of Shenyang, China | Ketamine Hydrochloride：0.3g/2ml,Xylazine hydrochloride:0.3g/2ml, Phenacetin hydrochloride：1mg/2ml | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Life Technologies | D1306# | |
| DMEM | Life Technologies | 11965118# | |
| ECM | Sciencell | 1001# | |
| ECGS | Sciencell | 1052# | |
| Eppendorf Snap-Cap Microtube(1.5mL) | AXYGEN | MCT-150-C# | |
| Falcon 100mm Cell Culture Dish | Corning | 353003# | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | 10270-106# | |
| Flowjo v10.0 | |||
| Forceps | ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China | ||
| Heparin sodium | Jiangsu WanBang biopharmaceutical Co.,Ltd.China | ||
| Iodine tincture | Guilin LiFeng Medical Supplies Co.,Ltd.China | ||
| Miniature Pig (Bama or Wuzhishan) | Kang Yi Ecological Agriculture Co., Ltd, China | ||
| Mshot microscope | Guangzhou Micro-shot Technology Co., Ltd. | M152 | |
| Petri Dishes (150 x 15 mm) | Biologixgroup | 66-1515# | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070063# | |
| Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Vent Cap （T25） | Corning | 3289# | |
| Scissors | ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China | ||
| Serological Transfer Pipettes (10ml) | JET Biofil | GSP010010# | |
| Sterile Pasteur Pipette | GeneBrick | GY0025# | |
| Sterile Syringe Filter (0.22µm) | Millipore | SLGV033RS# | |
| Surgical scalpel | ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China | 22# | |
| Surgical suture | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., Ltd | 5-0# | |
| Syringe（5mL） | Shengguang Medical Instrument Co., Ltd.China | ||
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | GIBCO | 25200056# | |
| 75% Medical alcohol | Guilin LiFeng Medical Supplies Co.,Ltd.China | ||
| 20 x PBS solution (pH 7.4,Nuclease free) | Sangon Biotech | B540627# | |
| Medical disinfectant 84 liquid | Sichuan Province Yijieshi Medical Technology Co., Ltd | 450ml/bottle |
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