Minyatür Domuzlardan Birincil Aort Endotel Hücrelerinin İzolasyon ve Kültürü
Summary
Primer domuz aort endotel hücrelerinin (pAECs) minyatür domuzlardan izolasyonu için etkili bir enzimatik yöntem tanımlanmıştır. İzole primer pAEC’ler ksenotransplantasyonda immün ve koagülasyon yanıtını araştırmak için kullanılabilir.
Abstract
Xenotransplantasyon son dönem organ yetmezliği olan hastalar için insan organı sıkıntısı gidermek için umut verici bir yoldur, ve domuz uygun bir organ kaynağı olarak kabul edilir. Bağışıklık reddi ve pıhtılaşma ksenotransplantasyonun başarısı için iki önemli engeldir. Vasküler endotel hücresi (EC) yaralanması ve disfonksiyonu ksenotransplantasyonda inflamasyon ve koagülasyon yanıtlarının gelişimi için önemlidir. Bu nedenle, domuz etitik endotel hücrelerinin izolasyon (pAECs) bağışıklık reddi ve pıhtılaşma yanıtları araştırmak için gereklidir. Burada, minyatür domuzlardan son derece saflaştırılmış pAEC’lerin izolasyonu, karakterizasyonu ve genişlemesi için basit bir enzimatik yaklaşım geliştirdik. İlk olarak, minyatür domuz ketamin ile anestezi ve aort uzunluğu çıkarıldı. İkinci olarak, aort endotel yüzeyi 15 dk. Üçüncü, aort endotel yüzeyi bir hücre kazıyıcı ile sadece bir yönde kazınmış oldu (<10 kez) için% 0.005 kollajenaz IV sindirim çözeltisi maruz kaldı ve süreci sırasında sıkıştırılmış değildi Kazıma. Son olarak, 3. CD31-pozitif hücrelerin yüzdeleri sırasıyla %97.4 ± %1.2, %94.4 ± %1.1 ve %92.4 ± %1.7 (ortalama ± SD) idi. Kollajenaz IV konsantrasyonu, sindirim süresi, yönü ve sıklığı ve kazıma sıklığı ve yoğunluğu fibroblast kontaminasyonu azaltmak ve yüksek saflıkta ve ECs çok sayıda elde etmek için önemlidir. Sonuç olarak enzimatik yöntemimiz, minyatür domuz aortundaki EC'leri izole etmek için son derece etkili bir yöntemdir ve ksenotransplantasyonda immün ve pıhtılaşma yanıtlarını araştırmak için hücreler in vitro olarak genişletilebilir.
Introduction
Transplantasyon için mevcut organ sıkıntısı dünya çapındaolağanüstü bir sorundur 1. Çin Kızıl Haç Derneği’ne göre, 2018 yılında Çin’de son dönem organ yetmezliği olan hastaların sadece az sayıda uygun bir organ aldı.
Xenotransplantasyon organ yetersizliği sorununu çözmek için umut verici bir yoldur. Domuz organları anatomik ve fizyolojik benzerlikler nedeniyle insanlar için en uygun organ olarak kabul edilir2,3. Bir domuz ksenograft yetmezliği büyük ölçüde primat bağışıklık reddi ve pıhtılaşma yanıtları ile ilgilidir. Bu hücreler antikor, kompleman, sitokinler ve bağışıklık hücreleri (örneğin, T hücreleri, B hücreleri ve makrofajlar)4,5içeren primat bağışıklık sistemi ile etkileşime ilk beri domuz eti endotel hücreleri (ECs) kritiktir . Domuz eti ecs domuz organ ve adacık xenotransplantasyon hayati bir rol oynamaktadır6,7. Bu nedenle, ECs bir domuz grefti reddi ve pıhtılaşma yanıtları araştırmak için önemli hücrelerdir. Knenotransplantasyon araştırmaları için yüksek kaliteli domuz eti izolasyonu gereklidir.
Farklı organlardan (örneğin, kalp, böbrek, karaciğer ve aort) EC’leri izole etme girişimlerinde, xenotransplant ayarında8,9,10,11,12gibi çeşitli protokoller bildirilmiştir. Ancak, yalıtılmış EC’lerin ultra saf kültürünü korumak standart protokollerde olağanüstü bir sorundur. Sindirilmiş çözeltinin artan konsantrasyonu, uygun olmayan sindirim süresi ve sıyrık yoğunluğu mevcut çalışmalarda artmış fibroblast kontaminasyonuna katkıda bulunabilir8,10,13. Ayrıca, minyatür domuzizole pAECs yöntemi daha az çalışılmıştır. Burada, minyatür domuzlardan (Wuzhishan veya Bama) yüksek oranda saflaştırılmış pAEC’leri izole etmek için optimize edilmiş bir enzimatik yöntemi tanımlıyoruz. Protokoldeki birkaç adım fibroblast kontaminasyonunu azaltmak ve yüksek saflıkta EC’ler elde etmek için tasarlanmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Endotel hücreleri yaygın vasküler disfonksiyon araştırmalarında kullanılır, diyabet, doku rejenerasyonu, transplantasyon, ve kanserler14,15,16,17,18. Anlamak ve bu hastalıklarda ECs işlevini anlamak ve karakterize etmek için, farklı hastalıklı organ veya dokuların ECs izole etmek için çok sayıda yöntem bildirilmiştir8</sup…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Çalışma Guangdong Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı hibe, Hibe / Ödül Numarası: 2016A030313028 tarafından desteklenmiştir; Guangdong Eyaleti Tıbbi Bilimsel Araştırma Vakfı, Hibe/Ödül Numarası: B2018003; Shenzhen Bilim ve Teknoloji Vakfı, Hibe/Ödül Numarası: JCYJ20180306172449376, JCYJ20180306172459580, JCJY20160229204849975, GJHZ20170314171357556, JCYJ2016042511ve JCYJ201604281420444444444444444444444444444444444444444444444444444444444442; Shenzhen Longhua Bölge Bilim ve Teknoloji Vakfı, Hibe/Ödül Numarası: 2017013; Çin Ulusal Anahtar Ar-Ge Programı, Hibe/Ödül Numarası: 2017YFC103704; Shenzhen Tıp Sanming Projesi, Hibe / Ödül Numarası: SZSM201412020; Guangdong Eyaleti Yüksek Düzeyli Hastanelerin İnşaatı Için Özel Fonlar (2019); Shenzhen Yüksek Düzeyde Tıbbi Disiplin İnşaatı Fonu, Hibe/Ödül Numarası: 2016031638; Shenzhen Sağlık ve Aile Planlaması Komisyonu Vakfı, Hibe/Ödül Numarası: SZXJ2017021 ve SZXJ2018059. Biz Hancheng Zhang ve Zhicheng Zou Shenzhen Üniversitesi’nden el yazması hazırlanmasında yardımcı olmak için teşekkür ederiz.
Materials
| BD FACSAria II | BD Bioscience | ||
| Boneforceps | Beijing HeLi KeChuang Technology Development CO.,Ltd. China | HL-YGQ | |
| BOON Disposable Syringe (10ml) | Jiangsu Yile medical Article Co., Ltd. China | ||
| CD31-FITC antibody | Bio-Rad | MCA1746F | |
| Cell scraper | Corning | 3010# | |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138#-1G | |
| Compound ketamine injection | Veterinary Pharmaceutical Factory of Shenyang, China | Ketamine Hydrochloride：0.3g/2ml,Xylazine hydrochloride:0.3g/2ml, Phenacetin hydrochloride：1mg/2ml | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Life Technologies | D1306# | |
| DMEM | Life Technologies | 11965118# | |
| ECM | Sciencell | 1001# | |
| ECGS | Sciencell | 1052# | |
| Eppendorf Snap-Cap Microtube(1.5mL) | AXYGEN | MCT-150-C# | |
| Falcon 100mm Cell Culture Dish | Corning | 353003# | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | 10270-106# | |
| Flowjo v10.0 | |||
| Forceps | ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China | ||
| Heparin sodium | Jiangsu WanBang biopharmaceutical Co.,Ltd.China | ||
| Iodine tincture | Guilin LiFeng Medical Supplies Co.,Ltd.China | ||
| Miniature Pig (Bama or Wuzhishan) | Kang Yi Ecological Agriculture Co., Ltd, China | ||
| Mshot microscope | Guangzhou Micro-shot Technology Co., Ltd. | M152 | |
| Petri Dishes (150 x 15 mm) | Biologixgroup | 66-1515# | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070063# | |
| Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Vent Cap （T25） | Corning | 3289# | |
| Scissors | ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China | ||
| Serological Transfer Pipettes (10ml) | JET Biofil | GSP010010# | |
| Sterile Pasteur Pipette | GeneBrick | GY0025# | |
| Sterile Syringe Filter (0.22µm) | Millipore | SLGV033RS# | |
| Surgical scalpel | ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China | 22# | |
| Surgical suture | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., Ltd | 5-0# | |
| Syringe（5mL） | Shengguang Medical Instrument Co., Ltd.China | ||
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | GIBCO | 25200056# | |
| 75% Medical alcohol | Guilin LiFeng Medical Supplies Co.,Ltd.China | ||
| 20 x PBS solution (pH 7.4,Nuclease free) | Sangon Biotech | B540627# | |
| Medical disinfectant 84 liquid | Sichuan Province Yijieshi Medical Technology Co., Ltd | 450ml/bottle |
References
- Zhang, G. Y., Liao, T., Fu, X. B., Li, Q. F. Organ transplantation in China: concerns remain. Lancet. 385 (9971), 854-855 (2015).
- Ekser, B., et al. Clinical xenotransplantation: the next medical revolution?. Lancet. 379 (9816), 672-683 (2012).
- Cooper, D. K., Ekser, B., Ramsoondar, J., Phelps, C., Ayares, D. The role of genetically engineered pigs in xenotransplantation research. The Journal of Pathology. 238 (2), 288-299 (2016).
- Pober, J. S., Sessa, W. C. Evolving functions of endothelial cells in inflammation. Nature Reviews Immunology. 7 (10), 803-815 (2007).
- McGill, S. N., Ahmed, N. A., Christou, N. V. Endothelial cells: role in infection and inflammation. World Journal of Surgery. 22 (2), 171-178 (1998).
- Ekser, B., Cooper, D. K. Overcoming the barriers to xenotransplantation: prospects for the future. Expert Review of Clinical Immunology. 6 (2), 219-230 (2010).
- Yeom, H. J., et al. Porcine aortic endothelial cell genes responsive to selected inflammatory stimulators. The Journal of Veterinary Medical Science. 71 (11), 1499-1508 (2009).
- Beigi, F., et al. Optimized method for isolating highly purified and functional porcine aortic endothelial and smooth muscle cells. Journal of Cellular Physiology. 232 (11), 3139-3145 (2017).
- Jansen of Lorkeers, S. J., et al. Xenotransplantation of Human Cardiomyocyte Progenitor Cells Does Not Improve Cardiac Function in a Porcine Model of Chronic Ischemic Heart Failure. Results from a Randomized, Blinded, Placebo Controlled Trial. PLOS One. 10 (12), e0143953 (2015).
- Zhang, J., et al. Potential Antigens Involved in Delayed Xenograft Rejection in a Ggta1/Cmah Dko Pig-to-Monkey Model. Scientific Reports. 7 (1), 10024 (2017).
- Paris, L. L., et al. ASGR1 expressed by porcine enriched liver sinusoidal endothelial cells mediates human platelet phagocytosis in vitro. Xenotransplantation. 18 (4), 245-251 (2011).
- Paris, L. L., Chihara, R. K., Sidner, R. A., Tector, A. J., Burlak, C. Differences in human and porcine platelet oligosaccharides may influence phagocytosis by liver sinusoidal cells in vitro. Xenotransplantation. 19 (1), 31-39 (2012).
- Bernardini, C., et al. Heat shock protein 70, heat shock protein 32, and vascular endothelial growth factor production and their effects on lipopolysaccharide-induced apoptosis in porcine aortic endothelial cells. Cell Stress & Chaperones. 10 (4), 340-348 (2005).
- Endemann, D. H., Schiffrin, E. L. Endothelial dysfunction. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 15 (8), 1983-1992 (2004).
- Graupera, M., Claret, M. Endothelial Cells: New Players in Obesity and Related Metabolic Disorders. Trends in Endocrinology and Metabolism: TEM. 29 (11), 781-794 (2018).
- Kawamoto, A., Asahara, T., Losordo, D. W. Transplantation of endothelial progenitor cells for therapeutic neovascularization. Cardiovascular Radiation Medicine. 3 (3-4), 221-225 (2002).
- Rafii, S., Lyden, D. Therapeutic stem and progenitor cell transplantation for organ vascularization and regeneration. Nature Medicine. 9 (6), 702-712 (2003).
- Jain, R. K., et al. Endothelial cell death, angiogenesis, and microvascular function after castration in an androgen-dependent tumor: role of vascular endothelial growth factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (18), 10820-10825 (1998).
- Pratumvinit, B., Reesukumal, K., Janebodin, K., Ieronimakis, N., Reyes, M. Isolation, characterization, and transplantation of cardiac endothelial cells. BioMed Research International. 2013, 359412 (2013).
- Crouch, E. E., Doetsch, F. FACS isolation of endothelial cells and pericytes from mouse brain microregions. Nature Protocols. 13 (4), 738-751 (2018).
- Nakano, H., Nakano, K., Cook, D. N. Isolation and Purification of Epithelial and Endothelial Cells from Mouse Lung. Methods in Molecular Biology. 1799, 59-69 (2018).
- Naschberger, E., et al. Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma – An Improved Protocol. Journal of Visualized Experiments. (134), e57400 (2018).
- Yu, S., et al. Isolation and characterization of endothelial colony-forming cells from mononuclear cells of rat bone marrow. Experimental Cell Research. 370 (1), 116-126 (2018).
- Chi, L., Delgado-Olguin, P. Isolation and Culture of Mouse Placental Endothelial Cells. Methods in Molecular Biology. 1752, 101-109 (2018).
- Hawthorne, W. J., Lew, A. M., Thomas, H. E. Genetic strategies to bring islet xenotransplantation to the clinic. Current Opinion in Organ Transplantation. 21 (5), 476-483 (2016).
- Yi, E., et al. Mechanical Forces Accelerate Collagen Digestion by Bacterial Collagenase in Lung Tissue Strips. Frontiers in Physiology. 7, 287 (2016).
- Masson-Pevet, M., Jongsma, H. J., De Bruijne, J. Collagenase- and trypsin-dissociated heart cells: a comparative ultrastructural study. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 8 (10), 747-757 (1976).
- Yonenaga, K., et al. Optimal conditions of collagenase treatment for isolation of articular chondrocytes from aged human tissues. Regenerative Therapy. 6, 9-14 (2017).
- French, M. F., Mookhtiar, K. A., Van Wart, H. E. Limited proteolysis of type I collagen at hyperreactive sites by class I and II Clostridium histolyticum collagenases: complementary digestion patterns. Biochimie. 26 (3), 681-687 (1987).
- Hara, H., et al. In vitro investigation of pig cells for resistance to human antibody-mediated rejection. Transplant International: Official Journal of the European Society for Organ Transplantation. 21 (12), 1163-1174 (2008).
- Takashima, A. Establishment of fibroblast cultures. Current Protocols in Cell Biology. Chapter 2, 2.1.1-2.1.12 (2001).
