استخدام مجهرية القوة الذرية لقياس الخصائص الميكانيكية وضغط التورغور للخلايا النباتية والأنسجة النباتية
Summary
هنا، نقدم مجهرية القوة الذرية (AFM)، تعمل كأداة المسافات البادئة نانو والدقيقة على الخلايا والأنسجة. تسمح الأداة بالحصول في وقت واحد على طوبوغرافيا سطح 3D للعينة وخصائصها الميكانيكية، بما في ذلك معامل جدار الخلية يونغ، فضلا عن ضغط التورغور.
Abstract
نقدم هنا استخدام مجهرية القوة الذرية لأنسجة النبات المسافة البادئة واستعادة خصائصه الميكانيكية. باستخدام اثنين من المجاهر المختلفة في وضع المسافة البادئة، ونحن نعرض كيفية قياس معامل مرنة واستخدامها لتقييم خصائص جدار الخلية الميكانيكية. وبالإضافة إلى ذلك، ونحن أيضا شرح كيفية تقييم ضغط التورغور. المزايا الرئيسية للميكروسكوب القوة الذرية هي أنه غير الغازية، سريع نسبيا (5 ~ 20 دقيقة)، وأنه يمكن تحليل أي نوع تقريبا من الأنسجة النباتية الحية التي هي مسطحة سطحيا دون الحاجة إلى العلاج. القرار يمكن أن تكون جيدة جدا، اعتمادا على حجم طرف وعلى عدد القياسات لكل منطقة وحدة. أحد قيود هذا الأسلوب هو أنه يعطي فقط الوصول المباشر إلى طبقة الخلية السطحية.
Introduction
ينتمي الفحص المجهري للقوة الذرية (AFM) إلى عائلة الفحص المجهري للمسبار المسحي (SPM)، حيث يقوم طرف بنصف قطر يبلغ عادة بضعة نانومترات بمسح سطح العينة. لا يتم الكشف عن سطح عن طريق الأساليب البصرية أو المستندة إلى الإلكترون، ولكن عن طريق قوى التفاعل بين الطرف وسطح العينة. وبالتالي، فإن هذه التقنية لا تقتصر على التوصيف الطبوغرافي لسطح العينة (دقة ثلاثية الأبعاد يمكن أن تنخفض إلى بضعة نانومترات)، بل تسمح أيضا بقياس أي نوع من قوى التفاعل مثل الكهروستاتيكي، فان دير والز أو قوى الاتصال. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام الطرف لتطبيق القوى على سطح عينة بيولوجية وقياس التشوه الناتج، ما يسمى “المسافة البادئة”، من أجل تحديد خصائصه الميكانيكية (على سبيل المثال، معامل يونغ، خصائص لزجة).
الخصائص الميكانيكية لجدران الخلايا النباتية ضرورية يجب أخذها فيالاعتبار عند محاولة فهم الآليات الكامنة وراء العمليات التنموية 1،2،3. في الواقع، يتم التحكم في هذه الخصائص بإحكام أثناء التنمية، لا سيما منذ تليين جدار الخلية مطلوب للسماح للخلايا بالنمو. يمكن استخدام AFM لقياس هذه الخصائص ودراسة الطريقة التي تتغير بين الأعضاء والأنسجة أو مراحل النمو.
في هذه الورقة، ونحن نصف كيف نستخدم AFM لقياس كل من خصائص جدار الخلية الميكانيكية والضغط turgor. يتم عرض هذين الطلبين على اثنين من المجاهر AFM مختلفة ومفصلة هنا بعد.
Protocol
Representative Results
Discussion
يتم تحديد ظهور الأشكال في النباتات بشكل رئيسي من خلال معدل منسق واتجاه النمو خلال الزمان والمكان. يتم تغليف الخلايا النباتية في جدار خلية جامدة مصنوعة من مصفوفة polysaccharidic، الذي يلصق لهم معا. ونتيجة لذلك، يتم التحكم في توسيع الخلية من خلال التوازن بين ضغط التورغور سحب على جدار الخلية، وصلاب?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونود أن نشكر فريق بلاتيم على دعمه التقني، وكذلك أريزكي بودووأعضاء فريق الفيزياء الحيوية في مختبر RDP لإجراء مناقشات مفيدة.
Materials
| Growth medium | |||
| 1000x vimatin stock solution | used to make ACM, composition see Stanislas et al., 2017. Add to ACM after autoclaving, before pouring. | ||
| 1-N-Naphthylphthalamic acid (NPA) | Sigma-Aldrich/Merck | 132-66-1 | add to Arabidopsis medium, 10 μM. Add after autoclaving, before pouring. |
| agar-agar | Sigma-Aldrich/Merck | 9002-18-0 | add to Arabidopsis medium, 1% w/v. |
| agarose | Merck Millipore | 9012-36-6 | used to make solid ACM, 0.8% w/v. |
| Arabidopsis medium | Duchefa Biochimie | DU0742.0025 | For in vitro arabidopsis culture, 11.82g/L. |
| Calcium nitrate tetrahydrate | Sigma-Aldrich/Merck | 13477-34-4 | add to Arabidopsis medium, 2mM. |
| MURASHIGE & SKOOG MEDIUM | Duchefa Biochimie | M0221.0025 | Basal salt mixture, used to make ACM, 2.2g/L. |
| N6-benzyladenine (BAP) | Sigma-Aldrich/Merck | 1214-39-7 | used to make ACM, 555 nM. Add to ACM after autoclaving, before pouring. |
| oryzalin | Sigma-Aldrich/Merck | 19044-88-3 | for oryzalin treatement, 10 μg/mL. |
| plant preservation mixture (PPM) | Plant Cell Technology | used to make ACM, 0.1% v/v. Add to ACM after autoclaving, before pouring. | |
| Potassium hydroxide | Duchefa Biochimie | 1310-58-3 | used to make Arabidopsis medium and ACM, both pH 5.8. |
| sucrose | Duchefa Biochimie | 57-50-1 | used to make ACM, 1% w/v. |
| Tools for AFM | |||
| BioScope Catalyst BioAFM | Bruker | The AFM used for turgor pressure measurement in this protocol. | |
| Nanowizard III + CellHesion | JPK (Bruker) | The AFM used for measuring mechanical properties. | |
| Patafix | UHU | D1620 | |
| Reference elasitic structure | NanoIdea | 2Z00026 | |
| Reprorubber-Thin Pour | Flexbar | 16135 | biocompatible glue. |
| Spherical AFM tips | Nanoandmore | SD-SPHERE-NCH-S-10 | Tips used for measuring mechanical properties. |
References
- Du, F., Guan, C., Jiao, Y. Molecular mechanisms of leaf morphogenesis. Molecular Plant. 11, 1117-1134 (2018).
- Cosgrove, D. J. Growth of the plant cell wall. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 850-861 (2005).
- Dumais, J. Can mechanics control pattern formation in plants?. Current Opinion in Plant Biology. 10, 58-62 (2007).
- Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. Early flower development in Arabidopsis. The Plant Cell. 2, 755-767 (1990).
- Routier-Kierzkowska, A. L., et al. Cellular force microscopy for in vivo measurements of plant tissue mechanics. Plant Physiology. 158 (4), 1514-1522 (2012).
- Corson, F., et al. Turning a plant tissue into a living cell froth through isotropic growth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 8453-8458 (2009).
- Hervieux, N., et al. A mechanical feedback restricts sepal growth and shape in Arabidopsis. Current Biology. 26, 1019-1028 (2016).
- Stanislas, T., Hamant, O., Traas, J., Lecuit, T. Chapter 11 – In-vivo analysis of morphogenesis in plants. Methods in Cell. 139, 203-223 (2017).
- Beauzamy, L., Derr, J., Boudaoud, A. Quantifying hydrostatic pressure in plant cells using indentation with an atomic force microscope. Biophysical Journal. 108 (10), 2448-2456 (2015).
- Costa, K. D., Sim, A. J., Yin, F. C. P. Non-Hertzian Approach to Analyzing Mechanical Properties of Endothelial Cells Probed by Atomic Force Microscopy. Journal of Biomechanical Engineering. 128 (2), 176-184 (2006).
- Beauzamy, L., Louveaux, M., Hamant, O., Boudaoud, A. Mechanically, the shoot apical meristem of Arabidopsis behaves like a shell inflated by a pressure of about 1MPa. Frontiers in Plant science. 6 (1038), 1-10 (2015).
- Majda, M., et al. Mechanochemical polarization of contiguous cell walls shapes plant pavement cells. Developmental Cell. 43 (3), 290-304 (2017).
- Torode, T. A., et al. Branched pectic galactan in phloem-sieve-element cell walls: implications for cell mechanics. Plant Physiology. 176, 1547-1558 (2018).
- Farahi, R. H., et al. Plasticity, elasticity, and adhesion energy of plant cell walls: nanometrology of lignin loss using atomic force microscopy. Scientific Reports. 7, 152 (2017).
- Peaucelle, A., et al. Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis. Current Biology. 21, 1720-1726 (2011).
- Cosgrove, D. J. Diffuse growth of plant cell walls. Plant Physiology. 176, 16-27 (2018).
- Sader, J. E., Larson, I., Mulvaney, P., White, L. R. Method for the calibration of atomic force microscope cantilevers. Review of Scientific Instruments. 66 (7), 3789-3798 (1995).
- Sader, J. E., Chon, J. W. M., Mulvaney, P. Calibration of rectangular atomic force microscope cantilevers. Review of Scientific Instruments. 70 (10), 3967-3969 (1999).
- Sikora, A. Quantitative Normal Force Measurements by Means of Atomic Force Microscopy Towards the Accurate and Easy Spring Constant Determination. Nanoscience and Nanometrology. 2 (1), 8-29 (2016).
- Schillers, H., et al. Standardized Nanomechanical Atomic Force Microscopy Procedure (SNAP) for Measuring Soft and Biological Samples. Scientific Reports. 7 (1), (2017).
