Utilisation de la microscopie de force atomique pour mesurer les propriétés mécaniques et la pression turgor des cellules et des tissus végétaux

Summary

Ici, nous présentons la microscopie de force atomique (AFM), actionnée comme outil de nano- et de micro-indentation sur des cellules et des tissus. L'instrument permet l'acquisition simultanée de la topographie de surface 3D de l'échantillon et de ses propriétés mécaniques, y compris le modulus de la paroi cellulaire de Young ainsi que la pression de la turgor.

Abstract

Nous présentons ici l'utilisation de la microscopie de force atomique pour indenter les tissus végétaux et récupérer ses propriétés mécaniques. À l'aide de deux microscopes différents en mode d'indentation, nous montrons comment mesurer un modulus élastique et l'utilisons pour évaluer les propriétés mécaniques de la paroi cellulaire. En outre, nous expliquons également comment évaluer la pression de turgor. Les principaux avantages de la microscopie par force atomique sont qu'elle est non invasive, relativement rapide (5 à 20 min), et que pratiquement n'importe quel type de tissu végétal vivant qui est superficiellement plat peut être analysé sans avoir besoin de traitement. La résolution peut être très bonne, en fonction de la taille de la pointe et du nombre de mesures par zone unitaire. Une limitation de cette méthode est qu'elle ne donne qu'un accès direct à la couche cellulaire superficielle.

Introduction

La microscopie par force atomique (AFM) appartient à la famille de la microscopie de la sonde de balayage (SPM), où une pointe avec un rayon de quelques nanomètres scanne habituellement la surface d'un échantillon. La détection d'une surface n'est pas réalisée par des méthodes optiques ou à base d'électrons, mais par les forces d'interaction entre la pointe et la surface de l'échantillon. Ainsi, cette technique ne se limite pas à la caractérisation topographique d'une surface d'échantillon (résolution 3D qui peut descendre à quelques nanomètres), mais permet également la mesure de tout type de forces d'interaction telles que l'électrostatique, van der Waals ou les for....

Protocol

1.Mesure des propriétés mécaniques de mur de cellules

REMARQUE: L'exemple du gynoecium en développement d'Arabidopsis est présenté.

1. Préparation des échantillons biologiques
   1. Recueillir un bourgeon de fleur fermé au stade 9 à 10 (environ 0,5 mm de long) selon les étapes publiées détermination pour Arabidopsis⁴. Sous une jumelle, à l'aide d'une pince fine, ouvrez soigneusement le bourgeon pour vérifier le stade de développement et de recueillir le gynoecium situé au centre de la fleur.
   2. Mettre le gynoecium sur du ruban adhésif double placé au centr....

Results

La figure 1A et la figure 1B montrent une capture d'écran illustrant le résultat des étapes 1.3.4 à 1.3.6 du protocole, utilisées pour localiser une région d'intérêt où acquérir la carte QI. Il convient de mentionner que la région d'intérêt a été choisie afin de ne pas être sur une surface inclinée (c'est-à-dire aussi plate que possible). En fait, comme l'ont remarqué Routier et al.⁵, si l'axe d'indentatio.......

Discussion

L'émergence des formes dans les plantes est principalement déterminée par le taux coordonné et la direction de la croissance pendant le temps et l'espace. Les cellules végétales sont enfermées dans une paroi cellulaire rigide faite d'une matrice polysaccharidique, qui les colle ensemble. En conséquence, l'expansion cellulaire est contrôlée par l'équilibre entre la pression de turgor tirant sur la paroi cellulaire, et la rigidité de la paroi cellulaire résistant à cette pression. Afin de comprendre les mécanismes sous-jac.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
< fort > Croissance moyenne
1 000x solution mère			utilisée pour fabriquer de l’ACM, composition voir Stanislas et al., 2017. Ajouter à l’ACM après l’autoclavage, avant de verser.
Acide 1-N-Naphtylphtalamique (NPA)	Sigma-Aldrich/Merck	132-66-1	ajouter au milieu Arabidopsis, 10 &mu ;M. Ajouter après l’autoclavage, avant de verser.
Agar-agar	Sigma-Aldrich/Merck	9002-18-0	ajouter au milieu Arabidopsis, 1 % p/v.
Agarose	Merck Millipore	9012-36-6	utilisé pour fabriquer des MCA solides, 0,8 % p/v.
Arabidopsis moyen	Duchefa Biochimie	DU0742.0025	Pour culture in vitro d’arabidopsis, 11,82g/L.
Nitrate de calcium tétrahydraté	Sigma-Aldrich/Merck	13477-34-4	ajouter au milieu d’Arabidopsis, 2 mM.
MURASHIGE & SKOOG MEDIUM	Duchefa Biochimie	M0221.0025	Mélange de sels de base, utilisé pour la fabrication de l’ACM, 2,2 g/ L.
N6-benzyladénine (BAP)	Sigma-Aldrich/Merck	1214-39-7	utilisé pour fabriquer de l’ACM, 555 nM. Ajouter à l’ACM après l’autoclavage, avant de verser.
Oryzalin	Sigma-Aldrich/Merck	19044-88-3	pour le traitement de l’oryzaline, 10 &mu ; g/mL.
Mélange de préservation des plantes (PPM)		cellules végétales	utilisée pour fabriquer de l’ACM, 0,1 % v/v. Ajouter à l’ACM après l’autoclavage, avant de verser.
Hydroxyde de potassium	Duchefa Biochimie	1310-58-3	utilisé pour fabriquer le milieu Arabidopsis et l’ACM, tous deux pH 5,8.
Saccharose	Duchefa Biochimie	57-50-1	utilisé pour fabriquer de l’ACM, 1 % p/v.
Outils pour AFM
BioScope Catalyst BioAFM	Bruker		L’AFM utilisé pour la mesure de la pression de turgescence dans ce protocole.
Nanowizard III + CellHesion	JPK (Bruker)		L’AFM utilisé pour mesurer les propriétés mécaniques.
Patafix	UHU	D1620
Référence structure élastitique	NanoIdea	2Z00026
Reprorubber-Thin Pour	Flexbar	16135	colle biocompatible.
Embouts AFM sphériques	Nanoandmore	SD-SPHERE-NCH-S-10	Embouts utilisés pour la mesure des propriétés mécaniques.