Användning av atomkraft mikroskopi för att mäta mekaniska egenskaper och turgor trycket av växtceller och växt vävnader
Summary
Här presenterar vi Atom kraftmikroskopi (AFM), som drivs som ett nano-och mikro-indenteringsverktyg på celler och vävnader. Instrumentet möjliggör samtidig förvärv av 3D-ytan topografi av provet och dess mekaniska egenskaper, inklusive cell Wall Youngs Modulus samt saft tryck.
Abstract
Vi presenterar här användningen av atomkraft mikroskopi att strecksats växt vävnader och återvinna dess mekaniska egenskaper. Med hjälp av två olika Mikroskop i indrag läge, visar vi hur man mäter en elastisk Modulus och använda den för att utvärdera cell Väggs mekaniska egenskaper. Dessutom förklarar vi hur man kan utvärdera saft tryck. De viktigaste fördelarna med atomkraft mikroskopi är att det är icke-invasiv, relativt snabb (5 ~ 20 min), och att praktiskt taget alla typer av levande växtvävnad som är ytligt platt kan analyseras utan behov av behandling. Upplösningen kan vara mycket bra, beroende på spets storlek och antalet mätningar per areaenhet. En begränsning av denna metod är att den endast ger direkttillgång till det ytliga cell skiktet.
Introduction
Atomkraft mikroskopi (AFM) tillhör scanning sond mikroskopi (SPM) Familj, där ett tips med en radie av vanligtvis några nanometer skannar ytan av ett prov. Detektering av en yta uppnås inte via optiska eller elektronbaserade metoder, utan via interaktions krafterna mellan spetsen och prov ytan. Således är denna teknik inte begränsad till topografisk karakterisering av ett prov yta (3D-upplösning som kan gå ner till några nanometer), men också möjliggör mätning av någon typ av interaktions styrkor såsom elektrostatisk, van der Waals eller kontakt styrkor. Dessutom kan spetsen användas för att tillämpa krafter på ytan av ett biologiskt prov och mäta den resulterande deformationen, den så kallade “indrag”, för att bestämma dess mekaniska egenskaper (t. ex. Youngs Modulus, viskoelastiska egenskaper).
Mekaniska egenskaper hos växternas cellväggar är viktiga att ta hänsyn till när man försöker förstå mekanismerna bakom utvecklingsprocesserna1,2,3. Faktum är att dessa egenskaper är tätt kontrollerade under utveckling, särskilt eftersom cellväggen mjukgörande krävs för att tillåta celler att växa. AFM kan användas för att mäta dessa egenskaper och studera hur de förändras mellan organ, vävnader eller utvecklingsstadier.
I detta dokument beskriver vi hur vi använder AFM för att mäta både mekaniska egenskaper i cellväggen och saft-tryck. Dessa två applikationer visas på två olika AFM Mikroskop och beskrivs här efter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Uppkomsten av former i växter bestäms främst av den samordnade takten och riktningen av tillväxten under tid och rum. Växtceller är inneslutna i en styv cell vägg gjord av en polysackarid matris, som livar ihop dem. Som ett resultat, cell expansion styrs av balansen mellan saft tryck dra på cellväggen, och stelhet i cellväggen motstå detta tryck. För att förstå mekanismerna bakom utvecklingen är det viktigt att kunna mäta både mekaniska egenskaper i cellväggen och saft-tryck i olika vävnader eller cell…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka PLATIM team för deras tekniska stöd, liksom arezki Boudaoud och medlemmar av Biophysic teamet på RDP Lab för hjälpsamma diskussioner.
Materials
| Growth medium | |||
| 1000x vimatin stock solution | used to make ACM, composition see Stanislas et al., 2017. Add to ACM after autoclaving, before pouring. | ||
| 1-N-Naphthylphthalamic acid (NPA) | Sigma-Aldrich/Merck | 132-66-1 | add to Arabidopsis medium, 10 μM. Add after autoclaving, before pouring. |
| agar-agar | Sigma-Aldrich/Merck | 9002-18-0 | add to Arabidopsis medium, 1% w/v. |
| agarose | Merck Millipore | 9012-36-6 | used to make solid ACM, 0.8% w/v. |
| Arabidopsis medium | Duchefa Biochimie | DU0742.0025 | For in vitro arabidopsis culture, 11.82g/L. |
| Calcium nitrate tetrahydrate | Sigma-Aldrich/Merck | 13477-34-4 | add to Arabidopsis medium, 2mM. |
| MURASHIGE & SKOOG MEDIUM | Duchefa Biochimie | M0221.0025 | Basal salt mixture, used to make ACM, 2.2g/L. |
| N6-benzyladenine (BAP) | Sigma-Aldrich/Merck | 1214-39-7 | used to make ACM, 555 nM. Add to ACM after autoclaving, before pouring. |
| oryzalin | Sigma-Aldrich/Merck | 19044-88-3 | for oryzalin treatement, 10 μg/mL. |
| plant preservation mixture (PPM) | Plant Cell Technology | used to make ACM, 0.1% v/v. Add to ACM after autoclaving, before pouring. | |
| Potassium hydroxide | Duchefa Biochimie | 1310-58-3 | used to make Arabidopsis medium and ACM, both pH 5.8. |
| sucrose | Duchefa Biochimie | 57-50-1 | used to make ACM, 1% w/v. |
| Tools for AFM | |||
| BioScope Catalyst BioAFM | Bruker | The AFM used for turgor pressure measurement in this protocol. | |
| Nanowizard III + CellHesion | JPK (Bruker) | The AFM used for measuring mechanical properties. | |
| Patafix | UHU | D1620 | |
| Reference elasitic structure | NanoIdea | 2Z00026 | |
| Reprorubber-Thin Pour | Flexbar | 16135 | biocompatible glue. |
| Spherical AFM tips | Nanoandmore | SD-SPHERE-NCH-S-10 | Tips used for measuring mechanical properties. |
References
- Du, F., Guan, C., Jiao, Y. Molecular mechanisms of leaf morphogenesis. Molecular Plant. 11, 1117-1134 (2018).
- Cosgrove, D. J. Growth of the plant cell wall. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 850-861 (2005).
- Dumais, J. Can mechanics control pattern formation in plants?. Current Opinion in Plant Biology. 10, 58-62 (2007).
- Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. Early flower development in Arabidopsis. The Plant Cell. 2, 755-767 (1990).
- Routier-Kierzkowska, A. L., et al. Cellular force microscopy for in vivo measurements of plant tissue mechanics. Plant Physiology. 158 (4), 1514-1522 (2012).
- Corson, F., et al. Turning a plant tissue into a living cell froth through isotropic growth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 8453-8458 (2009).
- Hervieux, N., et al. A mechanical feedback restricts sepal growth and shape in Arabidopsis. Current Biology. 26, 1019-1028 (2016).
- Stanislas, T., Hamant, O., Traas, J., Lecuit, T. Chapter 11 – In-vivo analysis of morphogenesis in plants. Methods in Cell. 139, 203-223 (2017).
- Beauzamy, L., Derr, J., Boudaoud, A. Quantifying hydrostatic pressure in plant cells using indentation with an atomic force microscope. Biophysical Journal. 108 (10), 2448-2456 (2015).
- Costa, K. D., Sim, A. J., Yin, F. C. P. Non-Hertzian Approach to Analyzing Mechanical Properties of Endothelial Cells Probed by Atomic Force Microscopy. Journal of Biomechanical Engineering. 128 (2), 176-184 (2006).
- Beauzamy, L., Louveaux, M., Hamant, O., Boudaoud, A. Mechanically, the shoot apical meristem of Arabidopsis behaves like a shell inflated by a pressure of about 1MPa. Frontiers in Plant science. 6 (1038), 1-10 (2015).
- Majda, M., et al. Mechanochemical polarization of contiguous cell walls shapes plant pavement cells. Developmental Cell. 43 (3), 290-304 (2017).
- Torode, T. A., et al. Branched pectic galactan in phloem-sieve-element cell walls: implications for cell mechanics. Plant Physiology. 176, 1547-1558 (2018).
- Farahi, R. H., et al. Plasticity, elasticity, and adhesion energy of plant cell walls: nanometrology of lignin loss using atomic force microscopy. Scientific Reports. 7, 152 (2017).
- Peaucelle, A., et al. Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis. Current Biology. 21, 1720-1726 (2011).
- Cosgrove, D. J. Diffuse growth of plant cell walls. Plant Physiology. 176, 16-27 (2018).
- Sader, J. E., Larson, I., Mulvaney, P., White, L. R. Method for the calibration of atomic force microscope cantilevers. Review of Scientific Instruments. 66 (7), 3789-3798 (1995).
- Sader, J. E., Chon, J. W. M., Mulvaney, P. Calibration of rectangular atomic force microscope cantilevers. Review of Scientific Instruments. 70 (10), 3967-3969 (1999).
- Sikora, A. Quantitative Normal Force Measurements by Means of Atomic Force Microscopy Towards the Accurate and Easy Spring Constant Determination. Nanoscience and Nanometrology. 2 (1), 8-29 (2016).
- Schillers, H., et al. Standardized Nanomechanical Atomic Force Microscopy Procedure (SNAP) for Measuring Soft and Biological Samples. Scientific Reports. 7 (1), (2017).
