פלטפורמת מיקרופלואידיג לעירור כונדרוציטים עם דחיסה דינמית
Summary
מאמר זה מספק שיטות מפורטות לגבי בדיית ואפיון מכשיר מיקרופלואידיג בעלי דלקת ריאות לדחיסת כונדרוציט.
Abstract
גירויים מכניים ידועים לווסת פונקציות ביולוגיות של תאים ורקמות. מחקרים שנעשו לאחרונה הציעו כי הלחץ בלחיצה משנה את ארכיטקטורת הסחוס לוחית הצמיחה ותוצאות אפנון גדילה של עצמות ארוכות של ילדים. כדי לקבוע את התפקיד של מתח הדוק בצמיחת העצם, יצרנו מכשיר מיקרופלואידיג המופעל על ידי הלחץ הפניאומטי, באופן דינאמי (או סטטי) לדחוס את צלחת הצמיחה כונדרוציטים מוטבע בגלילים הידרוג’ל של קילוף פלסטיצידיות. במאמר זה אנו מתארים שיטות מפורטות לבדיית ואפיון התקן זה. היתרונות של הפרוטוקול שלנו הם: 1) חמישה גניטודות שונים של לחץ מדגיש ניתן ליצור על חמש משכפל טכני בפלטפורמה אחת, 2) קל לדמיין את המבנה התא באמצעות מיקרוסקופ אור קונבנציונאלי, 3) תאים יכולים להיות מבודדים במהירות מהמכשיר לאחר הדחיסה כדי להקל על המטה במורד הזרם, ו -4) ניתן ליישם את הפלטפורמה על מנת ללמוד מכניאולוגיה של כל סוג תא שיכול לצמוח בהידרולים.
Introduction
פלטפורמות מיקרו מהונדסים הם כלים יקרי ערך ללמוד את הביולוגיה מולקולרית, תאית, רקמות ברמה כי הם לאפשר שליטה דינמית הן מיקרוסביבות פיזיות וכימיות1,2,3 ,4,5,6,7,8. לפיכך, ניתן לבדוק השערות רבות באופן סימולטני בצורה מבוקרת היטב. במקרה של סחוס הצלחת הצמיחה, יש להגדיל את העדויות של תפקיד חשוב של הלחץ בלחיצה בצמיחה עצם מודליטינג באמצעות פעולה על הסחוס לוחית הצמיחה9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22,23,24,25. עם זאת, מנגנון הפעולה של מתח ברור – בפרט, כיצד מנחה המתח את היווצרות עמודי כונדרוציטים בצלחת הצמיחה-מובן בצורה גרועה.
המטרה של פרוטוקול זה היא ליצור התקן מיקרופלאידיג מיקרו מבחינה כונדרולוגיה מכשיר דחיסה26 כדי להבהיר מנגנונים של מכניביולוגיה בצלחת הצמיחה כונדרוציטים (איור 1א-ג). המכשיר מורכב משני חלקים: יחידת האקטוציה הפניאומטית ובניית ג’ל האלגיאט. יחידת האקטואריה הפניאומטית של מיקרופלואידיג מפוברק בעזרת polydiמתיל siloxane (PDMS) בהתבסס על הצילום-וליתוגרפיה הרכה. יחידה זו מכילה 5 x 5 מערך של בלוני קרום PDMS דק אשר ניתן מנופח באופן שונה בהתבסס על קטרים שלהם. בניית ג’ל קילוף פלסטיצידיות מורכב כונדרוציטים מוטבע 5 x 5 מערך של בגלילים ג’ל קילוף פלסטיצידיות, ואת בנייה קילוף פלסטיצידיות כונדרוציטים מורכבים עם יחידת הגשמה. מבנים ג’ל קילוף פלסטיצידיות נדחסים על ידי בלונים pdms מנופח בדרך הריאה (איור 1b). המכשיר המיקרו-פלואידיג יכול ליצור חמש רמות שונות של לחץ הדוק בו זמנית בפלטפורמה אחת המבוססת על הבדלים בקוטר בלון PDMS. לפיכך, ניתן לבדוק את התפוקה הגבוהה של כונדרולוגיה ביולוגית בתנאי דחיסה מרובים.
המכשיר microflu, המתואר בפרוטוקול זה יש יתרונות רבים על התקן הדחיסה המקובלת כגון תופסני חיצוניים14,21,23 ו התקנים דחיסה מאקרוסקופי16, מיכל בן 19 , בן 27 , 28 ללימוד כונדרוביולוגיה מכניאולוגיה: 1) המכשיר microflu, מיקרופלואידים הוא עלות אפקטיבית משום שהוא צורכת נפח קטן יותר של דגימות מאשר התקן דחיסה מאקרוסקופי, 2) המכשיר microflu, c הוא הזמן יעיל כי זה יכול לבדוק מספר תנאי דחיסה בו זמנית, 3) מכשיר המיקרו-פלואידיג יכול לשלב גירויים מכניים וכימיים על ידי יצירת מעבר ריכוז של כימיקלים המבוססים על ערבוב מוגבל במיקרוערוצים, ו-4. טכניקות מיקרוסקופ שונות (בזמן הצניחה מיקרוסקופיה ומיקרוסקופיה של מיקרוסקופ הקרינה הפלואורסצנטית) ניתן להחיל עם מכשיר מיקרופלואידיג מתוצרת PDMS שקופה.
אימצנו ושינו את השיטה של moraes ואח ‘7,29 כדי ליצור רמות מצוקה שונות של הלחץ במכשיר אחד כדי לאפשר תפוקה גבוהה לימודי מכניבביולוגיה של דחיסת כchondrocyte. הגישה שלנו מתאים לתאים (למשל, כונדרוציטים) אשר צריך תלת מימדי (3d) התרבות הסביבה עבור בחני יולוגי לאחר דחיסת תאים. למרות שחלק מהתקני הדחיסה של תא microflu, מיקרופלואידים יכולים לדחוס תאים הנמצאים בשימוש בשני מימדים (2d) ב-30,31,32, לא ניתן להשתמש בהם עבור כונדרוציטים כגון כונדרוציטים מסוג 2d להבדיל. יש פלטפורמות מיקרופלואידיג לדחיסת תאים תלת-ממדיים באמצעות הידרו-ג’ל פוטופוליזציה7,33, אבל הם מוגבלים בבידוד תאים אחרי ניסויים בדחיסה משום שבידוד תאים מפוטופוליזציה הידרוג’ל אינו קל. בנוסף, ההשפעות של אולטרה סגול (UV) חשיפה ומיזמים מרובי קישורים על התאים ייתכן שיהיה צורך להעריך. לעומת זאת, השיטה שלנו מאפשרת בידוד מהיר של תאים לאחר ניסויים הדחיסה עבור פוסט ביולוגי בחני כי קילוף פלסטיצידיות הידרוג יכול להיות מקובע במהירות על ידי מכשירי סידן. בפרוטוקול זה מתוארים השיטות המפורטות לייצור ואפיון. הליך קצר עבור בדיית כונדרופלואידיג מכשיר דחיסה מוצג באיור 2.
Protocol
Representative Results
Discussion
כדי לבדוק את ההשפעות של לחץ מדגיש על לוחית הצמיחה כונדרוציטים, פיתחנו את מכשיר הדחיסה microflu, כונדרוציטים (איור 1) כדי להחיל רמות שונות של מתח בלחץ על כונדרוcytes בפיגום הידרו-ג’ל לתלת-ממד תרבות בדרכים של תפוקה גבוהה. כדי לסייע לחוקרים אחרים לאמץ את המכשיר שלנו או לפתח מכשירים דו?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לד”ר כריסטופר מוראיס וסטיבן א. מורין על תמיכתם בעיצוב ובייצור המכשירים. מחקר זה היה נתמך על ידי Bioהנדסאים למענק בריאות האדם מאוניברסיטת נברסקה-לינקולן (UNL) ו אוניברסיטת נברסקה המרכז הרפואי (UNL), ולהעניק AR070242 מ NIH/NIAMS. אנו מודים לג א. טיילור ו ג’יימס ר. Talaska של המתקן המיקרוסקופיה המתקדמת במרכז הרפואי של אוניברסיטת נברסקה למתן סיוע במיקרוסקופיה.
Materials
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane (ATPES) | Sigma-Aldrich | 741442-100ML | |
| (Tridecafluoro-1, 1, 2, 2-Tetrahydrooctyl)-1-Trichlorosilane | United Chemical Technologies | T2492-KG | |
| Acrylic sheet | McMaster-Carr | 8560K354 | |
| Air pump | Schwarzer Precision | SP 500 EC-LC4.5V DC | We used the model purchased in 2015. The internal design and performance of air pump (SP 500 EC-LC) changed in early 2016. Also, air pump performance has changed in the course of time. Thus, air pressure generated by an SP 500 EC-LC air pump should be calibrated before use. |
| Alginate powder | FMC Corporation | Pronova UP MVG | |
| Barb Straight Connectors (Metal tube) | Pneumadyne | EB40-250 | |
| Calcein AM | Invitrogen | C3100MP | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11960-044 | |
| Dyed red aqueous fluorescent particles | Thermo Fisher Scientific | R0100 | |
| EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | 22980 | |
| Foam pad | GRAINGER | Item # 5GCE8 | |
| Function / Arbitrary Waveform Generator | Keysight Technologies | 33210A | |
| Hydrochloric acid | Fisher Chemical | A144-500 | |
| Hydrogen peroxide | Fisher BioReagents | BP2633500 | |
| Isopropyl alcohol | BDH1174-4LP | VWR | |
| Microscope slides | Thermo Fisher Scientific | 22-267-013 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Power supply | Keysight Technologies | E3630A | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Chemical | S318-1 | |
| Solenoid manifold | Pneumadyne | MSV10-1 | |
| Solenoid valve | Pneumadyne | S10MM-30-12-3 | |
| Spin coater | Laurell Technologies | WS-650Mz-23NPPB | |
| SU8 Developer | MicroChem Corp. | Y020100 4000L1PE | |
| SU8-100 | MicroChem Corp. | Y131273 0500L1GL | |
| SU8-5 | MicroChem Corp. | Y131252 0500L1GL | |
| Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) | Thermo Fisher Scientific | 24510 | |
| Sulfuric acid | EMD Millipore | MSX12445 |
References
- Lu, H., et al. Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion. Analytical Chemistry. 76 (18), 5257-5264 (2004).
- Malek, A. M., Izumo, S. Mechanism of endothelial cell shape change and cytoskeletal remodeling in response to fluid shear stress. Journal of Cell Science. 109 (4), 713-726 (1996).
- Paguirigan, A. L., Beebe, D. J. Microfluidics meet cell biology: bridging the gap by validation and application of microscale techniques for cell biological assays. BioEssays. 30 (9), 811-821 (2008).
- García-Cardeña, G., Comander, J., Anderson, K. R., Blackman, B. R., Gimbrone, M. A. Biomechanical activation of vascular endothelium as a determinant of its functional phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (8), 4478-4485 (2001).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Moraes, C., Chen, J. H., Sun, Y., Simmons, C. A. Microfabricated arrays for high-throughput screening of cellular response to cyclic substrate deformation. Lab on a Chip. 10 (2), 227-234 (2010).
- Moraes, C., Wang, G., Sun, Y., Simmons, C. A. A microfabricated platform for high-throughput unconfined compression of micropatterned biomaterial arrays. Biomaterials. 31 (3), 577-584 (2010).
- Sundararaghavan, H. G., Monteiro, G. A., Firestein, B. L., Shreiber, D. I. Neurite growth in 3D collagen gels with gradients of mechanical properties. Biotechnology and Bioengineering. 102 (2), 632-643 (2009).
- Bougault, C., Paumier, A., Aubert-Foucher, E., Mallein-Gerin, F. Molecular analysis of chondrocytes cultured in agarose in response to dynamic compression. BMC Biotechnology. 8 (1), 71 (2008).
- Kaviani, R., Londono, I., Parent, S., Moldovan, F., Villemure, I. Compressive mechanical modulation alters the viability of growth plate chondrocytes in vitro. Journal of Orthopaedic Research. 33 (11), 1587-1593 (2015).
- Ménard, A. L., et al. In vivo dynamic loading reduces bone growth without histomorphometric changes of the growth plate. Journal of Orthopaedic Research. 32 (9), 1129-1136 (2014).
- Robling, A. G., Duijvelaar, K. M., Geevers, J. V., Ohashi, N., Turner, C. H. Modulation of appositional and longitudinal bone growth in the rat ulna by applied static and dynamic force. Bone. 29 (2), 105-113 (2001).
- Sergerie, K., et al. Growth plate explants respond differently to in vitro static and dynamic loadings. Journal of Orthopaedic Research. 29 (4), 473-480 (2011).
- Valteau, B., Grimard, G., Londono, I., Moldovan, F., Villemure, I. In vivo dynamic bone growth modulation is less detrimental but as effective as static growth modulation. Bone. 49 (5), 996-1004 (2011).
- Walsh, A. J. L., Lotz, J. C. Biological response of the intervertebral disc to dynamic loading. Journal of Biomechanics. 37 (3), 329-337 (2004).
- Zimmermann, E. A., et al. In situ deformation of growth plate chondrocytes in stress-controlled static vs dynamic compression. Journal of Biomechanics. 56, 76-82 (2017).
- Akyuz, E., Braun, J. T., Brown, N. A. T., Bachus, K. N. Static versus dynamic loading in the mechanical modulation of vertebral growth. Spine. 31 (25), E952-E958 (2006).
- Alberty, A., Peltonen, J., Ritsilä, V. Effects of distraction and compression on proliferation of growth plate chondrocytes: A study in rabbits. Acta Orthopaedica Scandinavica. 64 (4), 449-455 (1993).
- Amini, S., Veilleux, D., Villemure, I. Tissue and cellular morphological changes in growth plate explants under compression. Journal of Biomechanics. 43 (13), 2582-2588 (2010).
- Aronsson, D. D., Stokes, I. A. F., Rosovsky, J., Spence, H. Mechanical modulation of calf tail vertebral growth: implications for scoliosis progression. Journal of Spinal Disorders. 12 (2), 141-146 (1999).
- Cancel, M., Grimard, G., Thuillard-Crisinel, D., Moldovan, F., Villemure, I. Effects of in vivo static compressive loading on aggrecan and type II and X collagens in the rat growth plate extracellular matrix. Bone. 44 (2), 306-315 (2009).
- Reich, A., et al. Weight loading young chicks inhibits bone elongation and promotes growth plate ossification and vascularization. Journal of Applied Physiology. 98 (6), 2381-2389 (2005).
- Stokes, I. A., Mente, P. L., Iatridis, J. C., Farnum, C. E., Aronsson, D. D. Enlargement of growth plate chondrocytes modulated by sustained mechanical loading. Journal of Bone and Joint Surgery. 84 (10), 1842-1848 (2002).
- Stokes, I. A. F., Clark, K. C., Farnum, C. E., Aronsson, D. D. Alterations in the growth plate associated with growth modulation by sustained compression or distraction. Bone. 41 (2), 197-205 (2007).
- Lee, D., Erickson, A., Dudley, A. T., Ryu, S. Mechanical stimulation of growth plate chondrocytes: previous approaches and future directions. Experimental Mechanics. , (2018).
- Lee, D., Erickson, A., You, T., Dudley, A. T., Ryu, S. Pneumatic microfluidic cell compression device for high-throughput study of chondrocyte mechanobiology. Lab on a Chip. 18 (14), 2077-2086 (2018).
- Guilak, F. Compression-induced changes in the shape and volume of the chondrocyte nucleus. Journal of Biomechanics. 28 (12), 1529-1541 (1995).
- Knight, M. M., Ghori, S. A., Lee, D. A., Bader, D. L. Measurement of the deformation of isolated chondrocytes in agarose subjected to cyclic compression. Medical Engineering & Physics. 20 (9), 684-688 (1998).
- Moraes, C., Sun, Y., Simmons, C. A. Microfabricated platforms for mechanically dynamic cell culture. Journal of Visualized Experiments. (46), e224 (2010).
- Sim, W. Y., et al. A pneumatic micro cell chip for the differentiation of human mesenchymal stem cells under mechanical stimulation. Lab on a Chip. 7 (12), 1775-1782 (2007).
- Hosmane, S., et al. Valve-based microfluidic compression platform: single axon injury and regrowth. Lab on a Chip. 11 (22), 3888-3895 (2011).
- Ho, K. K. Y., Wang, Y. L., Wu, J., Liu, A. P. Advanced microfluidic device designed for cyclic compression of single adherent cells. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6 (148), (2018).
- Seo, J., et al. Interconnectable dynamic compression bioreactors for combinatorial screening of cell mechanobiology in three dimensions. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (16), 13293-13303 (2018).
- Erickson, A. G., et al. A tunable, three-dimensional in Vitro culture model of growth plate cartilage using alginate hydrogel acaffolds. Tissue Engineering Part A. 24 (1-2), 94-105 (2018).
- Lee, D., Rahman, M. M., Zhou, Y., Ryu, S. Three-dimensional confocal microscopy indentation method for hydrogel elasticity measurement. Langmuir. 31 (35), 9684-9693 (2015).
- Johnston, I. D., McCluskey, D. K., Tan, C. K. L., Tracey, M. C. Mechanical characterization of bulk Sylgard 184 for microfluidics and microengineering. Journal of Micromechanics and Microengineering. 24 (3), 035017 (2014).
