अनुप्रवाह आण्विक विश्लेषण और मेटास्टेटिक संभावित मूल्यांकन के लिए परिसंचारी ट्यूमर कोशिकाओं के micromanipulation
Summary
यहाँ, हम परिसंचारी ट्यूमर कोशिकाओं (ctcs) की विशेषता है कि लक्षणप्ररूपी और आणविक सुविधाओं की पहचान करने के लिए एक एकीकृत कार्यप्रवाह प्रस्तुत करते हैं । हम एकल और संकुल CTCs के अनुप्रवाह विश्लेषण और मेटास्टेसिस-बोने की क्षमता के मूल्यांकन के लिए एक सेल आधारित तकनीकों के साथ जीना immunostaining और रोबोट micromanipulation गठबंधन ।
Abstract
रक्त जनित मेटास्टेसिस सबसे कैंसर से संबंधित मौतों के लिए खातों और ट्यूमर कोशिकाओं (CTCs) है कि दूर साइटों पर नए ट्यूमर की स्थापना में सफल रहे है परिसंचारी शामिल है । CTCs एक उच्च मेटास्टेटिक क्षमता प्रदर्शित उत्तरार्द्ध के साथ एकल कोशिकाओं (एकल CTCs) के रूप में या बहु कोशिकीय समुच्चय (सीटीसी क्लस्टर और सीटीसी-सफेद रक्त कोशिका समूहों) के रूप में रोगियों के खून में पाए जाते हैं । गणना से परे, लक्षणप्ररूपी और आणविक विश्लेषण ctc जीवविज्ञान का विघटन और कार्रवाई की कमजोरियों की पहचान करने के लिए असाधारण रूप से महत्वपूर्ण है. यहां, हम एक कार्यप्रवाह है कि ctc immunostaining और micromanipulation, पूर्व vivo के लिए व्यक्तिगत कोशिकाओं के प्रफलन और अस्तित्व की क्षमताओं का आकलन संस्कृति शामिल है, और vivo में मेटास्टेसिस-गठन assays हैं, का एक विस्तृत विवरण प्रदान करते हैं । इसके अतिरिक्त, हम एक प्रोटोकॉल प्रदान करने के लिए पृथक्करण CTC क्लस्टर्स को व्यक्तिगत कक्षों में और इंट्रा-क्लस्टर विषमता की जांच । इन तरीकों के साथ, उदाहरण के लिए, हम संक्षेप में जीवन रक्षा और एकल ctcs और ctcs क्लस्टर्स के भीतर व्यक्तिगत कोशिकाओं के प्रफलन क्षमता, हमें इस प्रेक्षण के लिए अग्रणी है कि समूहों के भीतर कोशिकाओं को बेहतर अस्तित्व और पूर्व में प्रसार प्रदर्शन vivo संस्कृतियों एकल CTCS की तुलना में । कुल मिलाकर, हमारे कार्यप्रवाह एकल कोशिका स्तर पर CTCs की विशेषताओं को टुकड़े-टुकड़े करने के लिए एक मंच प्रदान करते हैं, जो मेटास्टेसिस-प्रासंगिक रास्ते की पहचान और सीटीसी जीवविज्ञान की एक बेहतर समझ की दिशा में लक्ष्य है ।
Introduction
दूर के अंगों में मेटास्टेसिस की नैदानिक अभिव्यक्ति कैंसर प्रगति और कैंसर से अधिक ९०% के लिए खातों के अंतिम चरण का प्रतिनिधित्व करता है से संबंधित मौतें1. मेटास्टेटिक रोग के लिए स्थानीयकृत से संक्रमण एक बहु कदम प्रक्रिया है, अक्सर परिसंचारी ट्यूमर कोशिकाओं (ctcs)2,3,4द्वारा मध्यस्थता । इन कोशिकाओं को रक्त परिसंचरण में प्राथमिक ट्यूमर से बहाया जाता है और दूर के अंगों को ले जाया जाता है, जहां वे extravasate और मेटास्टेटिक घावों5,6स्थापित कर सकते हैं । हालांकि ठोस ट्यूमर CTCs की एक अपेक्षाकृत उच्च संख्या जारी कर सकते हैं, सबसे CTCs मरने के लिए किस्मत में हैं, संचलन में उच्च कतरनी बलों के कारण, anoikis-मध्यस्थता सेल मौत, प्रतिरक्षा हमले या सीमित क्षमताओं के लिए एक विदेशी microenvironment के अनुकूल करने के लिए7. इसलिए, यह उपकरण है कि उन CTCs कि metastasis-बोने की क्षमता के साथ संपंन है की आणविक सुविधाओं के विच्छेदन सक्षम स्थापित करने के लिए निर्णायक है । हाल ही में पूर्व नैदानिक और नैदानिक अध्ययनों से पता चलता है कि उपस्थिति और एकल ctcs और ctcs समूहों की मात्रा ठोस ट्यूमर के विभिन्न प्रकार के साथ रोगियों में एक बदतर परिणाम के साथ जुड़ा हुआ है8,9,10 , 11 , 12 , 13 , 14 . Ctc क्लस्टर्स दो या अधिक ctc के समूह हैं जो सर्कुलेशन के दौरान एक-दूसरे से अनुलग्न होते है और एकल ctc3,15,16की तुलना में मेटास्टेसिस बनाने में अधिक कुशल होते हैं । किसी क्लस्टर के भीतर कक्ष desmosomes और आसंजन जंक्शनों के माध्यम से मजबूत कोशिका-कोशिका आसंजन बनाए रखने, जो anoikis17,18से उबरने में मदद कर सकते हैं । हाल ही में, हमने देखा कि CTCs का क्लस्टरिंग stemness-और प्रसार-संबद्ध ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर्स के लिए बाइंडिंग साइट्स के hypomethylation से जुड़ा हुआ है, जिससे मेटास्टेसिस19को सफलतापूर्वक प्रारंभ करने की क्षमता बढ़ी है । Ctc क्लस्टर वियोजन परिणाम कुंजी बाइंडिंग साइटों के remodeling में, और फलस्वरूप, उनके मेटास्टेटिक संभावित19का दमन । इसके अतिरिक्त कैंसर की कोशिकाओं के समूहों के लिए, ctcs भी सफेद रक्त कोशिका (सबसे अक्सर neutrophils) संचलन में उच्च प्रसार स्तर को बनाए रखने और उनके मेटास्टेटिक क्षमता20बढ़ाने के लिए संबद्ध कर सकते हैं । हालांकि, CTCs के जीवविज्ञान केवल हिस्से में समझा जाता है और कई सवाल खुले रहते हैं, जिनमें अंतर्निहित आणविक सुविधाएँ और एकल और संकुल कोशिकाओं की खामियां शामिल हैं ।
हाल के वर्षों में, कई रणनीतियों की स्थापना की है कि सेल-सतह अभिव्यक्ति पैटर्न के रूप में के रूप में अच्छी तरह से ctcs के भौतिक गुणों का शोषण उनके अलगाव के लिए21,22,23,24, 25. प्रतिजन पर निर्भर अलगाव के तरीकों ज्यादातर कोशिका सतह उपकला कोशिका आसंजन अणु (epcam)26की अभिव्यक्ति पर भरोसा करते हैं । सबसे अक्सर प्रयोग किया जाता है और (वर्तमान में) CTC गणन के लिए केवल एफडीए को मंजूरी दी मंच, CellSearch प्रणाली है, जो एक दो कदम प्रक्रिया पर Ctc को अलग करने के लिए21आधारित है । पहले चरण में, प्लाज्मा घटकों को अपकेंद्रण द्वारा हटा दिया जाता है, जबकि CTCs को एंटी-EpCAM एंटीबॉडी के साथ युग्मित चुंबकीय फेरोफ्लूइड के साथ कैप्चर किया जाता है । दूसरे चरण में, सीटीसी-संवर्धित समाधान (dapi-positive) कोशिकाओं के लिए दाग होता है जो कोशिकाकर्तिन (CK)8,18,19को व्यक्त करते हैं, जबकि श्वेत रक्त कोशिकाओं (wbcs) का उपयोग करके पहचाना जाता है पैन-ल्यूकोसाइट मार्कर CD45 । अंत में, पर कब्जा कर लिया कोशिकाओं को एक एकीकृत स्क्रीनिंग मंच पर रखा जाता है और CTCs EpCAM, CKs, और DAPI की अभिव्यक्ति के माध्यम से पहचाने जाते हैं, जबकि CD45 के लिए नकारात्मक किया जा रहा है । हालांकि यह सीटीसी गणना के लिए स्वर्ण मानक माना जाता है, डाउनस्ट्रीम आणविक विश्लेषण सीटीसी पुनः प्राप्ति में अंतर्निहित बाधाओं के कारण इस तकनीक के साथ चुनौतीपूर्ण है । इसके अतिरिक्त, अपने अलगाव की प्रक्रिया को देखते हुए, CellSearch उच्च EpCAM अभिव्यक्ति के साथ ctcs की तुलना में अधिक के साथ सीटीसी का संवर्धन एहसान कर सकते हैं, के लिए उदाहरण के लिए कैंसर विषमता27 या उपकला मार्करों के downregulation के लिए कारण 28,29. इन सीमाओं से उबरने के लिए, सीटीसी के संवर्धन के लिए प्रतिजन-स्वतंत्र प्रौद्योगिकियां उभर कर आई हैं । उदाहरण के लिए, CTC-iChip, शेष रक्त अवयवों से Ctc और WBCs सहित न्यूनीकृत कोशिकाओं के हाइड्रोडायनेमिक पृथक्करण को एकीकृत करता है, जिसके बाद एंटीबॉडी-टैग की गई WBCs की इम्यूनोमैग्नेटिक कमी होती है, जिसमें अनटैग और व्यवहार्य Ctc की शुद्धि की अनुमति है समाधान25। इसके अतिरिक्त, तथ्य यह है कि अधिकांश ctcs थोड़ा लाल रक्त कोशिकाओं (rbcs) या wbcs से बड़ा आकार के विकास के लिए नेतृत्व में सीटीसी संवर्धन प्रौद्योगिकियों23,30 (जैसे, parsortix प्रणाली (कोण)) जो एक का उपयोग करता है microfluidic आधारित प्रौद्योगिकी, जुदाई कैसेट भर में एक संकीर्ण चैनल शामिल है, या तो 10, 8, ६.५ या ४.५ μm (विभिन्न आकारों के एक टर्मिनल अंतराल के लिए अग्रणी कोशिकाओं को लक्षित कैंसर कोशिकाओं के संभावित व्यास के आधार पर उपलब्ध हैं). अधिकांश रक्त कोशिकाएं संकीर्ण अंतर से गुजरती हैं, जबकि CTCs अपने आकार के कारण फंस जाता है (लेकिन यह भी उनके कम विकृति की वजह से) और इसलिए, कैसेट में बने रहते हैं । प्रवाह की दिशा वापस ले कब्जा कर लिया CTCs, जो एक व्यवहार्य राज्य में है और नीचे की ओर विश्लेषण के लिए उपयुक्त है की रिहाई सक्षम बनाता है । CTC अलगाव के लिए चुना प्रोटोकॉल के स्वतंत्र रूप से, तथापि, ठेठ बाद संवर्धन प्रक्रियाओं अभी भी Ctc कि RBCs और WBCs की एक अपेक्षाकृत छोटी संख्या के साथ मिश्रित कर रहे है उपज, शुद्ध एकल या थोक Ctc चुनौतीपूर्ण का विश्लेषण कर रही है । इस मुद्दे को संबोधित करने के लिए, हम एक कार्यप्रवाह है कि संभावित रक्त कोशिका contaminants द्वारा शुरू पूर्वाग्रह के बिना CTC हेरफेर की अनुमति देता है की स्थापना की । पहले से ही immunostaining के अलावा, चर एंटीबॉडी-संयोजनों के साथ, CTCs रक्त कोशिकाओं से अलग है और यहां तक कि विशिष्ट सतह मार्कर अभिव्यक्ति प्रोफाइल के साथ CTCS उपसमूहों की पहचान करने के लिए अनुमति देता है । यह उच्च अनुकूलन प्रक्रिया तो आगे विशिष्ट डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के साथ संयुक्त किया जा सकता है ।
यहां, हम एक कार्यप्रवाह है कि एक CTC-संवर्धित उत्पाद से शुरू होता है का वर्णन (पसंद के किसी भी सीटीसी संवर्धन प्रौद्योगिकी के साथ प्राप्त) और एक सेल संकल्प पर CTC जीवविज्ञान में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए कई तरीकों को जोड़ती है । संक्षेप में, हमारे कार्यप्रवाह लाइव immunostaining द्वारा एकल ctcs, सीटीसी क्लस्टर्स और सीटीसी-wbc क्लस्टर्स की पहचान करने में सक्षम बनाता है, इसके बाद एकल-कोशिका micromanipulation और डाउनस्ट्रीम विश्लेषण द्वारा ex vivo संवर्धन प्रोटोकॉल, एकल सेल का उपयोग अनुक्रमण, और vivo में मेटास्टेसिस assays हैं ।
Protocol
Representative Results
Discussion
Ctcs के आणविक लक्षण वर्णन के लिए मेटास्टेटिक प्रक्रिया के बारे में हमारी समझ में सुधार और नए विरोधी metastasis चिकित्सा के विकास के मार्गदर्शन के लिए वादा रखती है । यहां हम उन प्रोटोकॉल का एक विस्तृत वर्णन है कि …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम सभी रोगियों है कि हमारे अध्ययन के लिए रक्तदान, साथ ही सभी शामिल चिकित्सकों और अध्ययन नर्सों धंयवाद । हम Jens Eberhardt धंयवाद, Uwe Birke, और डॉ कैथरीन के निरंतर समर्थन के लिए स्वचालित लैब समाधान GmbH से Uhlig । हम प्रतिक्रिया और चर्चाओं के लिए Aceto लैब के सभी सदस्यों को धंयवाद । Aceto लैब में शोध यूरोपीय अनुसंधान परिषद, यूरोपीय संघ, स्विस राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन, स्विस कैंसर लीग, बेसल कैंसर लीग, ETH Zürich के माध्यम से बेसल के दो कैंटन, और बेसल विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित है ।
Materials
| Anti-human EpCAM-AF488 | Cell Signaling Technology | CST5198 | clone: VU1D9 |
| 1X DPBS | Invitrogen | 14190169 | no calcium, no magnisium |
| 6-wells Ultra-low attachment plate | Corning | 3471 | |
| Anti-human CD45-BV605 | Biolegend | 304041 | clone: HI30 |
| Anti-human EGFR-FITC | GeneTex | GTX11400 | clone: ICR10 |
| Anti-human HER2-AF488 | Biolegend | 324410 | clone: 24D2 |
| Anti-mouse CD45-BV605 | Biolegend | 103139 | clone: 30-F11 |
| BD Vacutainer K2EDTA | BD | 366643 | for human blood collection |
| Cell Celector | ALS | CC1001 | core unit |
| CellD software | ALS | version 3.0 | |
| Cultrex PathClear Reduced Growth Factor BME, Type 2 | R&D Systems | 3533-005-02 | |
| Micro tube 1.3 mL K3EDTA | Sarstedt | 41.3395.005 | for mouse blood collection |
| PCR tubes | Corning | PCR-02-L-C | |
| RLT Plus | Quiagen | 1053393 | |
| SUPERase In RNase Inhibitor | Thermo Fisher | AM2696 | 1 U/µL |
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