Micromanipulation de cellules tumorales circulantes pour l’analyse moléculaire en aval et l’évaluation du potentiel métastatique

Résumé

Ici, nous présentons un workflow intégré pour identifier les caractéristiques phénotypiques et moléculaires qui caractérisent les cellules tumorales circulantes (CTCs). Nous combinons l’immunocoloration en direct et la micromanipulation robotisée de CTCS simples et groupés avec des techniques à cellules uniques pour l’analyse en aval et l’évaluation de la capacité d’ensemencement des métastases.

Résumé

Les métastases transmises par le sang représentent la plupart des décès liés au cancer et impliquent des cellules tumorales circulantes (CTCs) qui réussissent à établir de nouvelles tumeurs dans des sites éloignés. Les CTCs se retrouvent dans la circulation sanguine des patients en tant que cellules individuelles (CTCs uniques) ou en agrégats multicellulaires (grappes de CTC et grappes de globules blancs CTC), ce dernier affichant une capacité métastatique plus élevée. Au-delà de l’énumération, l’analyse phénotypique et moléculaire est extraordinairement importante pour disséquer la biologie de la CCT et identifier les vulnérabilités exploitables. Ici, nous fournissons une description détaillée d’un workflow qui inclut l’immunocoloration et la micromanipulation de CTC, la culture ex vivo pour évaluer les capacités prolifératives et de survie des cellules individuelles, et les essais in vivo de formation de métastase. En outre, nous fournissons un protocole pour réaliser la dissociation des grappes de CTC dans les cellules individuelles et l’étude de l’hétérogénéité intra-grappe. Avec ces approches, par exemple, Nous quantifions précisément la survie et le potentiel prolifératif des CTCs uniques et des cellules individuelles dans les grappes de CTC, nous conduisant à l’observation que les cellules dans les grappes affichent une meilleure survie et prolifération dans les ex par rapport aux CTCS uniques. dans l’ensemble, notre flux de travail offre une plate-forme pour disséquer les caractéristiques des CTCS au niveau de la cellule unique, visant à identifier les voies pertinentes des métastases et à mieux comprendre la biologie de la CCT.

Introduction

La manifestation clinique des métastases dans les organes éloignés représente l’étape finale de la progression du cancer et compte pour plus de 90% des décès liés au cancer¹. La transition de la maladie localisée à la métastatique est un processus à étapes multiples, souvent médiatisé par les cellules tumorales circulantes (CTCS)^2,3,4. Ces cellules sont excréées de la tumeur primaire dans la circulation sanguine et sont transportées vers des organes éloignés, où elles peuvent extravasate et établir des lésions métastatiques^5<....

Protocole

Toutes les procédures impliquant des échantillons sanguins de patients ont été effectuées sur consentement éclairé signé des participants. Les procédures ont été exécutées selon les protocoles EKNZ BASEC 2016-00067 et EK 321/10, approuvés par la Commission d’examen éthique et institutionnel (Comité d’éthique Nord-Ouest/Suisse centrale [EKNZ]), et conformément à la déclaration d’Helsinki.

Toutes les procédures concernant les animaux ont été exécutées en conformité avec les directives institutionnelles et cantonales (protocole de souris approuvé #2781, Office cantonal des vétérinaires de Bâle-ville).

1. préparation d....

Résultats

Le workflow présenté permet la préparation de CTCs individuels, soit à partir de CTCs uniques, soit séparés des clusters CTC. Les CTCs des patients ou des souris porteuses de tumeurs sont enrichis de sang total avec les méthodes d’enrichissement de la CCT disponibles, puis colorées avec des anticorps dirigés contre des marqueurs associés au cancer (p. ex., EpCAM, vert) et des marqueurs spécifiques à la WBC (p. ex., CD45, rouge) (figure 1a ). Le produit teinté.......

Discussion

La caractérisation moléculaire des CTCs tient la promesse d’améliorer notre compréhension du processus métastatique et de guider le développement de nouvelles thérapies anti-métastases. Ici, nous fournissons une description détaillée de ces protocoles qui permettent la micromanipulation de CTC et l’analyse en aval, y compris les essais fonctionnels à base de cellules uniques, l’analyse d’expression génique et la transplantation in vivo pour le potentiel métastatique l’évaluation²⁰.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Anti-humain EpCAM-AF488	Technologie de signalisation cellulaire	CST5198	clone : VU1D9
1X DPBS	Invitrogen	14190169	sans calcium, sans magnisium
6 puits Plaque de fixation ultra-basse	Corning	3471
Anti-humain CD45-BV605	Biolegend	304041	clone : HI30
Anti-humain EGFR-FITC  ;	Clone	de GeneTex GTX11400	: ICR10
Anti-humain HER2-AF488  ;	Clone Biolegend	324410	: 24D2
Anti-souris CD45-BV605	Clone 103139 Biolegend		: 30-F11
BD Vacutainer K2EDTA	BD	366643	pour le prélèvement de sang humain
Cell Celector	ALS	CC1001	core unit  ;
Logiciel CellD	ALS		version 3.0
Cultrex PathClear Facteur de croissance réduit BME, Type 2	R& D Systems	3533-005-02
Microtube 1,3 mL K3EDTA	Sarstedt	41.3395.005	pour prélèvement sanguin de souris
Tubes PCR	Corning	PCR-02-L-C
RLT Plus	Quiagen	1053393
SUPERase  ; Dans l’inhibiteur de RNase	Thermo Fisher	AM2696	; 1 U/µ ; L  ;