近红外荧光和高分辨率扫描测量啮齿类动物大脑中蛋白质的表达
Summary
在这里, 我们提出了一个协议, 使用近红外染料结合免疫组织化学和高分辨率扫描来检测大脑区域的蛋白质。
Abstract
神经科学是研究大脑中的细胞如何调节各种功能的研究。测量神经元和胶质细胞中的蛋白质表达对于神经科学的研究至关重要, 因为细胞功能是由细胞蛋白的组成和活性决定的。在本文中, 我们描述了免疫细胞化学如何可以结合近红外高分辨率扫描, 以提供在不同的大脑区域的蛋白质表达的半定量测量。这项技术可用于同一大脑区域的单蛋白或双蛋白表达。用这种方式测量蛋白质可以通过实验操作、学习和记忆的分子特征、分子途径中的活动以及多个大脑区域的神经活动来获得蛋白质表达的相对变化。通过正确的蛋白质和统计分析, 也可以确定大脑区域之间的功能连接。鉴于在实验室实施免疫细胞化学很容易, 使用具有近红外高分辨率扫描的免疫细胞化学可以扩大神经学家在系统层面检查神经生物学过程的能力。
Introduction
神经科学的研究涉及对大脑中细胞如何介导特定功能的研究 1。这些可能是细胞性质的, 例如胶质细胞如何在中枢神经系统中赋予免疫, 或者可能涉及旨在解释海马背侧神经元的活动如何导致空间导航的实验。从广义上讲, 细胞功能是由细胞中表达的蛋白质和这些蛋白质的活性2决定的。因此, 测量脑细胞中蛋白质的表达和活性对于神经科学的研究至关重要。
有许多技术可以用来测量大脑中的蛋白质表达。这些方法包括体内方法, 如受体密度为 3的正电子发射地形和小肽4的微透析。更常见的是, 体外方法被用来检查蛋白质的功能和表达。其中包括质谱技术5、西方印迹和酶联免疫吸附法 (elisa)6和免疫细胞化学7。免疫细胞化学在神经科学领域得到了广泛的应用。这项技术涉及使用初级抗体检测感兴趣的蛋白质 (或抗原) (例如 c-Fos) 和共轭二级抗体来检测蛋白质-初级抗体复合物 (图 1)。为了能够检测蛋白-初级抗体-二级抗体复合物, 二级抗体具有氧化剂, 如辣根过氧化物酶 (HRP) 结合到它们。这样就可以在细胞中形成沉淀物, 可以使用光学显微镜7检测到。继发性抗体也可以使化学物质与之结合在一起 (即荧光)。当受到刺激时, 这些化学物质会发光, 可用于检测蛋白质原代抗体-二级抗体复合物 7。最后, 有时初级抗体具有还原剂和荧光化学物质, 直接否定了对二级抗体的需求 ( 图 1)。
有趣的是, 许多免疫细胞化学方法允许对脑细胞中的蛋白质进行可视化, 但不能量化特定细胞或大脑区域中的蛋白质含量。使用光显微镜检测减少反应的沉淀物可以显示神经元和胶质细胞, 但这种方法不能用于量化蛋白质在细胞或特定大脑区域的表达。从理论上讲, 荧光显微镜可以用于这一点, 因为荧光二级抗体发出的光是对蛋白质-初级抗体-二级抗体复合物的测量。然而, 脑组织中的自体荧光可能会使使用荧光显微镜来量化脑组织中的蛋白质表达。因此, 脑组织荧光图像发出的光很少被用来量化大脑中的蛋白质表达。
其中许多问题可以通过近红外免疫细胞化学与高分辨率扫描9,10一起解决。在本文中, 我们描述了如何免疫细胞化学结合近红外发射光谱中的荧光, 可以结合高分辨率扫描 (例如, 10–21μm), 以获得清晰的图像, 允许在不同的蛋白质半定量大脑区域。
Protocol
Representative Results
Discussion
本文的研究结果表明, 近红外免疫细胞化学结合高分辨率扫描可用于获得脑组织中蛋白质表达的半定量指标。它还可以用来在同一大脑区域同时标记两种蛋白质。我们以前用近红外免疫组织化学来测量多个大脑区域9、10 的直接早期基因表达。即时早期基因可以用来衡量神经活动。我们还将这些蛋白质表达的半定量指标进行了统计分析, 使我们能够对大脑…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本报告中的研究由 NIGMS 的目标赠款 (1P20GM103653) 资助, 授予 DK。
Materials
| Brain Extraction | |||
| Anesthesia Induction Chamber | Kent Scientific | VetFlo-0530SM | |
| Kleine Guillotine | Harvard Apparatus | 73-1920 | |
| Friedman Rongeur | Fine Science Tools | 16000-14 | used to remove back of skull |
| Delicate Dissecting Scissors | Fischer Scientific | 08-951-5 | used to cut upward along midline of skull |
| Micro Spatula | Fischer Scientific | 21-401-5 | used to scoop out brain |
| Glass Microscope Slides | Fischer Scientific | 12-549-6 | |
| Immunohistochemical Reaction | |||
| Triton X-100 | Used as a mild detergent to permeabilize cells after fixing in Paraformaldehyde, also used as mild detergent in combination with host serum and secondary antibody | ||
| Tween-20 | Used as a small amount of detergent added to TBS to procuce TBS-T after coverslipping slides with primary antibody | ||
| Licor Odyssey scanner | Licor Biotechnology Inc. | ||
| Image Studio | Licor Biotechnology Inc. | ||
References
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