Brug af Near-Infrared fluorescens og høj opløsning scanning til at måle protein Expression i gnaver hjernen
Summary
Her præsenterer vi en protokol, der bruger nær-infrarøde farvestoffer sammen med Immunhistokemi og høj opløsning scanning til assay proteiner i hjernen regioner.
Abstract
Neurovidenskab er studiet af, hvordan celler i hjernen mægle forskellige funktioner. Måling protein udtryk i neuroner og glia er afgørende for studiet af neurovidenskab som cellulære funktion bestemmes af sammensætningen og aktiviteten af cellulære proteiner. I denne artikel beskriver vi, hvordan immuncytokemi kan kombineres med nærinfrarød scanning i høj opløsning for at give et semi-kvantitativt mål af protein udtryk i forskellige områder i hjernen. Denne teknik kan bruges til enkelt eller dobbelt protein udtryk i samme hjerneregion. Måling af proteiner på denne måde kan bruges til at opnå en relativ ændring i protein udtryk med en eksperimentel manipulation, Molekylær underskrift af indlæring og hukommelse, aktivitet i molekylære veje, og neurale aktivitet i flere hjerneregioner. Ved hjælp af de korrekte proteiner og statistisk analyse kan funktionel konnektivitet blandt hjerneregioner også bestemmes. I betragtning af den lethed at gennemføre immuncytokemi i et laboratorium, ved hjælp af immuncytokemi med nær-infrarød høj opløsning scanning kan udvide muligheden for Neuro videnskabsmand til at undersøge neurobiologiske processer på et systemniveau.
Introduction
Studiet af neurovidenskab vedrører en undersøgelse af, hvordan celler i hjernen mægle specifikke funktioner1. Disse kan være cellulære i naturen, såsom hvordan glia celler giver immunitet i det centrale nervesystem eller kan involvere eksperimenter, der har til formål at forklare, hvordan aktiviteten af neuroner i rygtet hippocampus fører til rumlig navigation. I bred forstand bestemmes cellulære funktion af de proteiner, der udtrykkes i en celle, og aktiviteten af disse proteiner2. Som et resultat, måling af udtryk og/eller aktivitet af proteiner i hjerneceller er afgørende for studiet af neurovidenskab.
En række teknikker er tilgængelige til at måle protein udtryk i hjernen. Disse omfatter in vivo metoder såsom Positron emission topografi for receptor tætheder3 og mikro-dialyse for små peptider4. Mere almindeligt, ex vivo metoder anvendes til at undersøge protein funktion og udtryk. Disse omfatter massespektrometri teknikker5, Western blot og enzym-linked immunosorbent assay (ELISA)6, og immuncytokemi7. Immunocytochemistry er meget udbredt inden for neurovidenskab. Denne teknik indebærer anvendelse af et primært antistof til påvisning af et protein (eller antigen) af interesse (f. eks. c-FOS) og et konjugeret sekundært antistof til påvisning af det protein-primære antistof kompleks (figur 1). For at muliggøre påvisning af det protein-primære antistof-sekundære antistof kompleks, har sekundære antistoffer oxiderende midler som peberrod peroxidase (HRP) konjugeret til dem. Dette giver mulighed for dannelsen af bundfald i celler, der kan påvises ved hjælp af let mikroskopi7. Sekundære antistoffer kan også have kemikalier fluoresceres konjugeret til dem (dvs., fluorophores). Når stimuleret disse kemikalier udsender lys, som kan bruges til at detektere protein-primære antistof-sekundære antistof komplekser7. Endelig, sommetider primære antistoffer har reduktionsmidler og fluorescens kemikalier knyttet til dem direkte virkningsløs behovet for sekundære antistoffer7 (figur 1).
Interessant, mange immuncytokemi metoder giver mulighed for visualisering af proteiner i hjerneceller, men ikke evnen til at kvantificere mængden af protein i en bestemt celle eller hjerneregion. Brug af let mikroskopi til at detektere bundfald fra reduktions reaktioner giver mulighed for visualisering af neuroner og glia, men denne metode kan ikke bruges til at kvantificere protein udtryk i celler eller i en bestemt hjerneregion. I teorien kan Fluorescens mikroskopi anvendes til dette, fordi det lys, der udsendes fra det fluorescerende sekundære antistof, er et mål for det protein-primære antistof-sekundære antistof kompleks. Men, autofluorescens i hjernevæv kan gøre det vanskeligt at bruge Fluorescens mikroskopi til at kvantificere protein ekspression i hjernevæv8. Som et resultat, lys udledt fra fluorescerende billeder af hjernevæv er sjældent bruges til at kvantificere protein udtryk i hjernen.
Mange af disse problemer kan løses ved hjælp af nærinfrarød immuncytokemi sammen med højopløsnings scanning9,10. I denne artikel beskriver vi, hvordan immuncytokemi kombineret med fluorophores i de nærinfrarøde emissions spektre kan kombineres med scanning i høj opløsning (f. eks. 10 – 21 μm) for at opnå skarpe billeder, der giver mulighed for semi kvantificering af protein i særskilte områder i hjernen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De resultater, der præsenteres i denne artikel viser, at nær-infrarød immuncytokemi i kombination med høj opløsning scanning kan bruges til at opnå semi-kvantitative målinger af protein udtryk i hjernevæv. Det kan også bruges til at mærke to proteiner samtidigt i samme hjerneregion. Vi har tidligere brugt nær-infrarød Immunhistokemi til at måle umiddelbar tidlig genekspression i flere hjerneregioner9,10. Umiddelbare tidlige gener kan bruges som et m?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskningen i denne rapport blev finansieret af et mål-tilskud fra NIGMS (1P20GM103653), der blev tildelt DK.
Materials
| Brain Extraction | |||
| Anesthesia Induction Chamber | Kent Scientific | VetFlo-0530SM | |
| Kleine Guillotine | Harvard Apparatus | 73-1920 | |
| Friedman Rongeur | Fine Science Tools | 16000-14 | used to remove back of skull |
| Delicate Dissecting Scissors | Fischer Scientific | 08-951-5 | used to cut upward along midline of skull |
| Micro Spatula | Fischer Scientific | 21-401-5 | used to scoop out brain |
| Glass Microscope Slides | Fischer Scientific | 12-549-6 | |
| Immunohistochemical Reaction | |||
| Triton X-100 | Used as a mild detergent to permeabilize cells after fixing in Paraformaldehyde, also used as mild detergent in combination with host serum and secondary antibody | ||
| Tween-20 | Used as a small amount of detergent added to TBS to procuce TBS-T after coverslipping slides with primary antibody | ||
| Licor Odyssey scanner | Licor Biotechnology Inc. | ||
| Image Studio | Licor Biotechnology Inc. | ||
References
- Kandel, E. R. . Principles of Neural Science. , (2013).
- Byrne, J. H., Roberts, J. L. . From Molecules to Networks: An Introduction to Cellular and Molecular Neuroscience. , (2009).
- Salami, A., et al. Dopamine D2/3 binding potential modulates neural signatures of working memory in a load-dependent fashion. Journal of Neuroscience. , (2018).
- Merali, Z., Khan, S., Michaud, D. S., Shippy, S. A., Anisman, H. Does amygdaloid corticotropin-releasing hormone (CRH) mediate anxiety-like behaviors? Dissociation of anxiogenic effects and CRH release. European Journal of Neuroscience. 20 (1), 229-239 (2004).
- English, J. A., et al. Dataset of mouse hippocampus profiled by LC-MS/MS for label-free quantitation. Data in Brief. 7, 341-343 (2016).
- David, M. A., Tayebi, M. Detection of protein aggregates in brain and cerebrospinal fluid derived from multiple sclerosis patients. Frontiers in Neurology. 5, 251 (2014).
- Oliver, C., Jamur, M. C. Immunocytochemical methods and protocols. Methods in Molecular Biology. , (2010).
- Spitzer, N., Sammons, G. S., Price, E. M. Autofluorescent cells in rat brain can be convincing impostors in green fluorescent reporter studies. Journal of Neuroscience Methods. 197 (1), 48-55 (2011).
- Knox, D., et al. Using c-Jun to identify fear extinction learning-specific patterns of neural activity that are affected by single prolonged stress. Behavioural Brain Researach. 341, 189-197 (2018).
- Knox, D., et al. Neural circuits via which single prolonged stress exposure leads to fear extinction retention deficits. Learning & Memory. 23 (12), 689-698 (2016).
- Malinow, R., Malenka, R. C. AMPA receptor trafficking and synaptic plasticity. Annual Review of Neuroscience. 25, 103-126 (2002).
- Nabavi, S., et al. Engineering a memory with LTD and LTP. Nature. 511 (7509), 348-352 (2014).
- Kimmelmann-Shultz, B., Mohammadmirzaei, N., Della Valle, R., Knox, D. Using high resolution near infrared imaging to measure fear-learning induced changes in AMPA/NMDA ratios throughout the fear circuit. , (2018).
- Eagle, A. L., et al. Single prolonged stress enhances hippocampal glucocorticoid receptor and phosphorylated protein kinase B levels. Neuroscience Research. 75 (2), 130-137 (2013).
