Широкоугольной однофотонной оптической записи в мозговых фрагментах с использованием чувствительных к напряжению красителя
Summary
Мы внедряем воспроизводимый и стабильный метод оптической записи для ломтиков мозга с помощью чувствительных к напряжению красителя. В статье описывается напряжение чувствительных красителя окрашивания и записи оптических сигналов с помощью обычных гиппокампа срез препаратов.
Abstract
Широкоугольное однополевое фотонное напряжение-чувствительное красителя (VSD) изображение препаратов среза мозга является полезным инструментом для оценки функциональной связи в нейронных цепях. Из-за дробного изменения светового сигнала было трудно использовать этот метод в качестве количественного анализа. В этой статье описана специальная оптика и системы обработки срезов, которые делают этот метод стабильным и надежным. В настоящей статье демонстрируется обработка ломтиков, окрашивание, и запись VSD окрашенных гиппокампа ломтиками в деталях. Система поддерживает физиологические условия в течение длительного времени, с хорошим окрашиванием, и предотвращает механические движения ломтика во время записи. Кроме того, это позволяет окрашивать ломтики с небольшим количеством красителя. Оптика достигает высокой численной диафрагмы при низком увеличении, что позволяет записывать сигнал VSD при максимальной частоте кадров 10 кГц, с 100 пиксельным х 100-пиксельным пространственным разрешением. Благодаря высокой частоте кадров и пространственному разрешению, этот метод позволяет применять фильтры после записи, которые обеспечивают достаточное соотношение сигнала к шуму для оценки изменений в нейронных схемах.
Introduction
Широкоугольное однополевое фотонное напряжение-чувствительное красителя (VSD) изображение навалом окрашенных препаратов ломтик мозга стало полезным количественным инструментом для оценки динамики нейронных цепей1,2,3,4 . После анализа изменений в оптических свойствах из-за возбуждения мембраны5,6,7, VSD изображений был впервые описан в начале 1970-х годов Коэн и другие6,8, 9. ; это подходящий метод для мониторинга функций мозга в режиме реального времени, как краситель непосредственно зондирует мембраны потенциальных изменений (т.е. основной сигнал нейронов).
Самые ранние VSD обладали желательными характеристиками, чтобы понять систему мозга, такие как быстрое время-постоянная следовать быстрой кинетики нейрональных мембранных потенциальных событий, и линейность с изменением мембранного потенциала9, 10 Лет , 11 Год , 12 Лет , 13 Год , 14 Год , 15. Как и в других экспериментах изображений, этот метод требует широкого спектра конкретных тюнингов, таких как камеры, оптика, программное обеспечение и срез физиологии, для достижения желаемых результатов. Из-за этих технических трудностей ожидаемые выгоды в ходе первоначальных усилий не обязательно материализовались для большинства лабораторий, которые не специализируются на этом методе.
Основной причиной технической сложности была низкая чувствительность VSD к мембранному потенциальному изменению при применении к объемному окрашиванию среза. Величина оптического сигнала (т.е. дробное изменение флуоресценции) обычно составляет 10-4-10-3 сигнала управления (F0) в физиологических условиях. Временной масштаб мембранного потенциального изменения в нейроне составляет примерно миллисекунды до нескольких сотен миллисекунд. Для измерения изменений в мембранном потенциале нейрона камера, используемая для записи, должна иметь возможность приобретать изображения с высокой скоростью (от 10 кГц до 100 Гц). Низкая чувствительность VSD и скорость, необходимая для следовыза тье нервного сигнала, требует большого количества света, который будет собираться на камеру на высокой скорости, с высоким соотношением сигнала к шуму (S/N)2,16.
Оптика системы записи также является критическим элементом для обеспечения сбора достаточного количества света и улучшения S/N. Увеличение достигается оптики часто чрезмерно низким, таких как 1X до 10X, чтобы визуализировать локальные функциональные нейронной цепи. Например, для визуализации динамики гиппокампа цепи, увеличение примерно 5 будет подходящим. Такое низкое увеличение имеет низкую эффективность флуоресценции; поэтому передовая оптика была бы полезна для такой записи.
Кроме того, срез физиологии также имеет важное значение. Так как анализ изображений требует, чтобы ломтики были нетронутыми, тщательная обработка срезов необходимо17. Кроме того, меры, принятые для поддержания жизнеспособности ломтик в течение более длительного времени имеют важное значение18.
В настоящей статье описывается протокол для подготовки ломтиков, VSD окрашивания, и измерений. В статье также излагаются улучшения VSDs, устройства визуализации и оптики, а также другие дополнительные уточнения экспериментальной системы, которые позволили использовать этот метод в качестве простого, мощного и количественного анализа для визуализации модификация функций мозга19,20,21,22,23,24,25. Техника также может быть широко использована для долгосрочного потенцирования в области CA1 гиппокампа ломтиками1. Кроме того, этот метод также полезен в оптической записи мембранных потенциалов в одной нервной клетке26.
Protocol
Representative Results
Discussion
Физиология срезов имеет жизненно важное значение для сбора правильного сигнала. Использование кольцевой системы фильтра в этом протоколе гарантирует, что срез остается здоровым и неискаженным на протяжении всей процедуры2,16,17. Другие…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
TT получил грант JSPS KAKENHI (JP16H06532, JP16K21743, JP16H06524, JP16K0038 и JP15K00413) от MEXT и гранты от Министерства здравоохранения, труда и социального обеспечения (MHLW-kagaku-ippan-H27 и H30 Мы хотели бы поблагодарить Editage (www.editage.jp) за редактирование английского языка.
Materials
| High speed image acquisition system | Brainvision co. Ltd. | MiCAM – Ultima | Imaging system |
| High speed image acquisition system | Brainvision co. Ltd. | MiCAM 02 | Imaging system |
| Macroscepe for wide field imaging | Brainvision co. Ltd. | THT macroscope | macroscope |
| High powere LED illumination system with photo-diodode stablilizer | Brainvision co. Ltd. | LEX-2G | LED illumination |
| Image acquisition software | Brainvision co. Ltd. | BV-ana | image acquisition software |
| Multifunctional electric stimulator | Brainvision co. Ltd. | ESTM-8 | Stimulus isolator+AD/DA converter |
| Slicer | Leica | VT-1200S | slicer |
| Slicer | Leica | VT-1000 | slicer |
| Blade for slicer | Feather Safety Razor Co., Ltd. | #99027 | carbon steel razor blade |
| Membrane filter for slice support | Merk Millipore Ltd., MA, USA | Omnipore, JHWP01300, 0.45 µm pores, | membrane filter/ 0.45 13 |
| Numerical analysis software | Wavemetrics Inc., OR, USA | IgorPro | analysing software |
| Stimulation isolator | WPI Inc. | A395 | Stimulus isolator |
| AD/DA converter | Instrutech | ITC-18 | AD/DA converter |
| Voltage sensitive dye Di-4-ANEPPS | Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | catalog number: D-1199 | VSD: Di-4-ANEPPS |
| poloxamer | Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | Pluronic F-127 P30000MP | poloxamer / Pluronic F-127 (20% solution in DMSO) |
| polyethoxylated castor oil | Sigma-Aldrich | Cremophor EL C5135 | polyethoxylated castor oil |
References
- Tominaga, Y., Taketoshi, M., Tominaga, T. Overall Assay of Neuronal Signal Propagation Pattern With Long-Term Potentiation (LTP) in Hippocampal Slices From the CA1 Area With Fast Voltage-Sensitive Dye Imaging. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 389 (2018).
- Tominaga, T., Kajiwara, R., Tominaga, Y. VSD Imaging Method of Ex Vivo Brain Preparation. Journal of Neuroscience and Neuroengineering. 2 (3), 211-219 (2013).
- Homma, R., et al. Wide-field and two-photon imaging of brain activity with voltage- and calcium-sensitive dyes. Methods Mol Biol. 364 (1529), 2453-2467 (2009).
- Grinvald, A., Hildesheim, R. VSDI: a new era in functional imaging of cortical dynamics. Nature Reviews Neuroscience. 5 (11), 874-885 (2004).
- Tasaki, I., Watanabe, A., Sandlin, R., Carnay, L. Changes in fluorescence, turbidity, and birefringence associated with nerve excitation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 61 (3), 883-888 (1968).
- Cohen, L., Keynes, R., Hille, B. Light Scattering and Birefringence Changes during Nerve Activity. Nature. 218 (5140), 438-441 (1968).
- Hill, D., Keynes, R. Opacity changes in stimulated nerve. The Journal of Physiology. 108 (3), 278-281 (1949).
- Waggoner, A., Salzberg, B., Davila, H., Cohen, L. A Large Change in Axon Fluorescence that Provides a Promising Method for Measuring Membrane Potential. Nature New Biology. 241 (109), 159 (1973).
- Salzberg, B., Davila, H., Cohen, L. Optical Recording of Impulses in Individual Neurones of an Invertebrate Central Nervous System. Nature. 246 (5434), (1973).
- Cohen, L., lzberg, B., Grinvald, A. Optical Methods for Monitoring Neuron Activity. Annual Review of Neuroscience. 1 (1), 171-182 (1978).
- Ross, W. N., Salzberg, B. M., Cohen, L. B., Davila, H. V. A large change in dye absorption during the action potential. Biophysical Journal. 14 (12), 983-986 (1974).
- Loew, L. M., Cohen, L. B., Salzberg, B. M., Obaid, A. L., Bezanilla, F. Charge-shift probes of membrane potential. Characterization of aminostyrylpyridinium dyes on the squid giant axon. Biophysical Journal. 47 (1), 71-77 (1985).
- Loew, L. M., et al. A naphthyl analog of the aminostyryl pyridinium class of potentiometric membrane dyes shows consistent sensitivity in a variety of tissue, cell, and model membrane preparations. The Journal of Membrane Biology. 130 (1), 1-10 (1992).
- Mullah, S., et al. Evaluation of Voltage-Sensitive Fluorescence Dyes for Monitoring Neuronal Activity in the Embryonic Central Nervous System. The Journal of Membrane Biology. 246 (9), 679-688 (2013).
- Momose-Sato, Y., Sato, K., Arai, Y., Yazawa, I., Mochida, H., Kamino, K. Evaluation of Voltage-Sensitive Dyes for Long-Term Recording of Neural Activity in the Hippocampus. Journal of Membrane Biology. 172 (2), 145-157 (1999).
- Tominaga, T., Tominaga, Y., Yamada, H., Matsumoto, G., Ichikawa, M. Quantification of optical signals with electrophysiological signals in neural activities of Di-4-ANEPPS stained rat hippocampal slices. Journal of Neuroscience Methods. 102 (1), 11-23 (2000).
- Tominaga, T., Ichikawa, M. Experimental apparatus for sliced specimen of biological tissue and specimen holder. US Patent. , (2002).
- Buskila, Y., Breen, P. P., Tapson, J., van Schaik, A., Barton, M., Morley, J. W. Extending the viability of acute brain slices. Scientific Reports. 4 (1), srep05309 (2015).
- Tanemura, K., et al. Neurodegeneration with Tau Accumulation in a Transgenic Mouse Expressing V337M Human Tau. Journal of Neuroscience. 22 (1), 133-141 (2002).
- Tominaga, Y., Ichikawa, M., Tominaga, T. Membrane potential response profiles of CA1 pyramidal cells probed with voltage-sensitive dye optical imaging in rat hippocampal slices reveal the impact of GABAA-mediated feed-forward inhibition in signal propagation. Neuroscience Research. 64 (2), 152-161 (2009).
- Suh, J., Rivest, A. J., Nakashiba, T., Tominaga, T., Tonegawa, S. Entorhinal Cortex Layer III Input to the Hippocampus Is Crucial for Temporal Association Memory. Science. 334 (6061), 1415-1420 (2011).
- Juliandi, B., et al. Reduced Adult Hippocampal Neurogenesis and Cognitive Impairments following Prenatal Treatment of the Antiepileptic Drug Valproic Acid. Stem cell reports. 5 (6), 1-14 (2016).
- Stepan, J., Dine, J., Eder, M. Functional optical probing of the hippocampal trisynaptic circuit in vitro: network dynamics, filter properties, and polysynaptic induction of CA1 LTP. Frontiers in Neuroscience. 9, 160 (2015).
- Tominaga, Y., Taketoshi, M., Tominaga, T. Overall Assay of Neuronal Signal Propagation Pattern With Long-Term Potentiation (LTP) in Hippocampal Slices From the CA1 Area With Fast Voltage-Sensitive Dye Imaging. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 389 (2018).
- Kajiwara, R., Tominaga, Y., Tominaga, T. Network Plasticity Involved in the Spread of Neural Activity Within the Rhinal Cortices as Revealed by Voltage-Sensitive Dye Imaging in Mouse Brain Slices. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 20 (2019).
- Popovic, M., Gao, X., Zecevic, D. Voltage-sensitive dye recording from axons, dendrites and dendritic spines of individual neurons in brain slices. Journal of visualized experiments. , (2012).
- Sakmann, B., Stuart, G. . Single-Channel Recording. , (1995).
- Tominaga, T., Tominaga, Y., Ichikawa, M. Optical imaging of long-lasting depolarization on burst stimulation in area CA1 of rat hippocampal slices. Journal of neurophysiology. 88 (3), 1523-1532 (2002).
- Mennerick, S., et al. Diverse Voltage-Sensitive Dyes Modulate GABAAReceptor Function. The Journal of Neuroscience. 30 (8), 2871-2879 (2010).
- Canitano, R., Pallagrosi, M. Autism Spectrum Disorders and Schizophrenia Spectrum Disorders: Excitation/Inhibition Imbalance and Developmental Trajectories. Frontiers in Psychiatry. 8, 69 (2017).
- Anticevic, A., Murray, J. D. Rebalancing Altered Computations: Considering the Role of Neural Excitation and Inhibition Balance Across the Psychiatric Spectrum. Biological Psychiatry. 81 (10), 816-817 (2017).
- Busche, M., Konnerth, A. Impairments of neural circuit function in Alzheimer’s disease. Phil. Trans. R. Soc. B. 371 (1700), 20150429 (2016).
- Knöpfel, T. Genetically encoded optical indicators for the analysis of neuronal circuits. Nature Reviews Neuroscience. 13 (10), 687 (2012).
- Knöpfel, T. Expanding the toolbox for remote control of neuronal circuits. Nature Methods. 5 (4), 293 (2008).
- Tominaga, T., Tominaga, Y. A new nonscanning confocal microscopy module for functional voltage-sensitive dye and Ca2+ imaging of neuronal circuit activity. Journal of Neurophysiology. 110 (2), 553-561 (2013).
