Nous décrivons les procédures de traitement du tissu cérébral du rat nouveau-né afin d’obtenir des micrographies électroniques à haute résolution pour l’analyse morphométrique de la distribution des vésicules synaptiques aux terminaux nerveux. Les micrographies obtenues avec ces méthodes peuvent également être utilisées pour étudier la morphologie d’un certain nombre d’autres composants cellulaires et leurs relations structurelles dimensionnelles.
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Article de méthode
Préparation du tissu cérébral nouveau-né du rat pour l’analyse morphométrique ultrastructurale de la distribution synaptique des vésicules aux terminaux nerveux
Dans cet article
Résumé
Résumé
Notre laboratoire et beaucoup d’autres ont exploité la haute puissance de résolution de la microscopie électronique à transmission pour étudier la morphologie et l’organisation spatiale des vésicules synaptiques. Afin d’obtenir des micrographies électroniques de haute qualité qui peuvent produire le degré de détail morphologique nécessaire à l’analyse quantitative de la distribution de vésicules présynaptiques, la préparation optimale des spécimens est essentielle. La fixation chimique est la première étape dans le processus de préparation des spécimens, et de la plus haute importance pour préserver l’ultrastructure fine. La fixation vasculaire avec une solution de glutaraldéhyde-formaldéhyde, suivie d’un traitement de spécimens coupés en vibratome avec du tétroxyde d’osmium, stabilise le nombre maximal de molécules, en particulier les protéines et les lipides, et entraîne une conservation supérieure de l’ultrastructure. Le tissu est ensuite traité avec une contre-coloration, une déshydratation séquentielle et une incorporation de résine. La coloration en bloc avec l’acétate d’uranyle (c.-à-d., coloration des tissus sectionnés par vibratome avant l’incorporation de résine) renforce le contraste endogène et stabilise les composants cellulaires contre l’extraction pendant le traitement des spécimens. Le contraste peut être augmenté davantage en appliquant l’acétate d’uranyle comme post-tache sur des sections ultrafines. La double coloration des coupes ultrafines avec le citrate de plomb après le traitement par l’acétate d’uranyle améliore également la résolution de l’image, en intensifiant l’opacité électronique des structures contenant de l’acide nucléique par liaison sélective du plomb à l’acétate d’uranyle. La microscopie électronique à transmission est un outil puissant pour caractériser les détails morphologiques des vésicules synaptiques et la quantification de leur taille et de leur organisation spatiale dans le bouton terminal. Cependant, parce qu’il utilise des tissus fixes, la microscopie électronique par transmission ne peut fournir que des informations indirectes sur les processus vivants ou en évolution. Par conséquent, d’autres techniques devraient être envisagées lorsque l’objectif principal est d’étudier les aspects dynamiques ou fonctionnels du trafic de vésicules synaptiques et de l’exocytose.
Introduction
Nous décrivons des méthodes pour la préparation du tissu cérébral nouveau-né de rat pour obtenir des micrographies électroniques de haute qualité pour l’analyse morphométrique en profondeur de la distribution spatiale des vésicules synaptiques aux bornes nerveuses1,2. Les micrographes à contraste élevé qui peuvent être obtenus en traitant des spécimens suivant ces méthodes peuvent également être utilisés pour étudier la morphologie détaillée d’un certain nombre de composants cellulaires et leurs relations structurelles dimensionnelles3,4.
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Protocole
Toutes les études ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de Virginie (Charlottesville, Virginie) et menées conformément aux lignes directrices des instituts nationaux de la santé.
1. fixation par perfusion vasculaire
Remarque: Une description générale de la méthode de perfusion vasculaire du cerveau de rat a déjà été décrite dans le présent journal13 et dépasse le cadre de ce protocole. Cependant, les étapes suivantes sont spécifiques pour la préparation du tissu cérébral nouveau-né de rat pour obtenir des microg....
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Résultats
Des critères généraux qui sont généralement acceptés comme indicatifs de préservation satisfaisante ou défectueuse de l’échantillon pour TEM ont été établis. Ces critères sont illustrés par quatre micrographies d’électrons choisies (deux exemples de préparation optimale, deux exemples de préparation défectueuse) qui ont été obtenus en traitant les jeunes tissus cérébraux de rat suivant les méthodes décrites dans ce protocole.
En général, un Micrographe électronique de bonne qualité apparaît co.......
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Discussion
La manipulation des sections tissulaires pendant la préparation des échantillons pour TEM nécessite un degré considérable de finesse, de concentration et de patience. Lors de l’utilisation d’une micropipette pour ajouter et enlever des solutions, les spécimens peuvent être aspirés dans l’embout de la pipette par tension de surface, il faut donc prendre soin d’éviter les lésions tissulaires par la pipette. En outre, certaines étapes de la séquence de déshydratation peuvent être aussi rapides que 1 min, d’où l’opérateur do.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Ce manuscrit a été appuyé par NIH/NIGMS K08 123321 (à N.L.) et par des fonds du département d’anesthésiologie de l’Université de Virginie. Les auteurs souhaitent remercier alev Erisir (département de biologie, Université de Virginie, Charlottesville, VA) pour l’excellente formation et l’assistance technique avec TEM, et pour sa critique inestimable de manuscrit. Les auteurs remercient également l’installation de microscopie électronique avancée à l’Université de Virginie pour l’assistance technique avec les échantillons de coupe et de post-coloration.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 4 % de tétroxyde d’osmium | Microscopie électronique Sciences | 19170 | acqueuse |
| 50 % de glutaraldéhyde | Microscopie électronique Sciences | 16310 | grade EM, acqueuse |
| Aclar 33 C film d’encastrement | Microscopie électronique Sciences | 50425-25 | 7,8 mil d’épaisseur, taille 8"x10 » |
| Porte-capsule BEEM | Microscopie électronique Sciences | 69916 | tient taille « 00 » capsules |
| BEEM capsules d’encastrement | Microscopie électronique Sciences | 70021 | "taille 00, plat (fond coupé)"Butler |
| block trimmer | Microscopie électronique Sciences | 69945-01 | |
| Pinceau en poil de chameau | Microscopie électronique Sciences | 65576-01 | |
| Poinçon à disque | Microscopie électronique Sciences | 77850-09 | |
| Embed 812 kit | Microscopie électronique Sciences | 14120 | |
| Acétate de plomb | Microscopie électronique Sciences | 17600 | |
| Citrate de plomb | Microscopie électronique Sciences | 17800 | |
| Nitrate de plomb | Microscopie électronique Sciences | 17900 | |
| Leica UC7 microtome ultracut | Leica | ||
| Micro scale | Microscopie électronique Sciences | 62091-23 | |
| Paraformaldéhyde | Microscopie électronique Sciences | 19208 | EM grade, granulaire |
| Précision Thelco four de laboratoire Thelco | 51221159 | ||
| Azoture de sodium | Sigma-Aldricht | S2002 | |
| StatMark stylo | Microscopie électronique Sciences | 72109-01 | |
| Tyrode solution | Microscopie électronique Sciences | 11760-05 | |
| Acétate d’uranyle | Microscopie électronique Sciences | 22400 | poudre |
Références
- Lunardi, N., Oklopcic, A., Prillaman, M., Erisir, A., Jevtovic-Todorovic, V. Early exposure to general anesthesia disrupts spatial organization of presynaptic vesicles in nerve terminals of the developing subiculum. Molecular Neurobiology. 52 (2), 942-951 (2015).
- Lunardi, N., Ori, C., Erisir, A., Jevtovic-Todorovic, V.
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Réimpressions et autorisations
