قياس النشاط شبه الخلوي يوبيكويتين بروتياسوم في الدماغ القوارض
Summary
تم تصميم هذا البروتوكول لتحديد قدر ة نشاط نظام يوبيكويتين بروتياسوم (UPS) بكفاءة في مقصورات خلوية مختلفة من الدماغ القوارض. ويتمكن المستخدمون من فحص أداء شركة UPS في الكسور النووية والسيتوبلازمية ومتشابكة في نفس الحيوان، مما يقلل من مقدار الوقت وعدد الحيوانات اللازمة لإجراء هذه التحليلات المعقدة.
Abstract
نظام فيوكويتين بروتياسوم هو منظم رئيسي لتدهور البروتين ومجموعة متنوعة من العمليات الخلوية الأخرى في eukaryotes. في الدماغ، ترتبط الزيادات في النشاط في يوبيكويتين بروتياسوم حاسمة للدونة متشابك وتكوين الذاكرة والتغيرات الشاذة في هذا النظام مع مجموعة متنوعة من الاضطرابات العصبية والعصبية والنفسية. واحدة من القضايا في دراسة العمل في كل مكان بروتيسوم في الدماغ هو أنه موجود في جميع المقصورات الخلوية, التي أهداف البروتين, دور وظيفي وآليات التنظيم يمكن أن تختلف على نطاق واسع. ونتيجة لذلك، فإن القدرة على المقارنة المباشرة لاستهداف بروتين في وبيكوتين الدماغ والنشاط الحفاز البروتياسوم في مقصورات تحت الخلية المختلفة داخل نفس الحيوان أمر بالغ الأهمية لفهم كامل كيف يساهم UPS في اللدونة متشابك، الذاكرة والمرض. الطريقة الموصوفة هنا تسمح بجمع الكسور النووية والسيتوبلازمية والخام متشابك من نفس القوارض (الفئران) الدماغ، تليها القياس الكمي في وقت واحد من النشاط الحفاز بروتياسوم (بشكل غير مباشر، وتوفير نشاط من جوهر بروتياسوم فقط) والربط محددة في كل من يوبيكويتين وضع العلامات البروتين. وهكذا، يمكن استخدام هذه الطريقة لمقارنة مباشرة التغيرات دون الخلوية في النشاط في يوبيكويتين بروتياسوم في مناطق الدماغ المختلفة في نفس الحيوان خلال اللدونة متشابك، وتشكيل الذاكرة وحالات المرض المختلفة. ويمكن أيضا استخدام هذه الطريقة لتقييم التوزيع دون الخلوي ووظيفة البروتينات الأخرى داخل نفس الحيوان.
Introduction
نظام ubiquitin-proteasome (UPS) هو شبكة معقدة من هياكل البروتين المترابطة والأربطة التي تتحكم في تدهور معظم البروتينات قصيرة الأجل في الخلايا1. في هذا النظام، يتم وضع علامة على البروتينات للتحلل أو غيرها من العمليات الخلوية / مصائر من قبل فيوكويتين المعدل الصغيرة. يمكن للبروتين المستهدف الحصول على 1-7 تعديلات يوبيكويتين، والتي يمكن أن تربط معا في واحد من سبعة مواقع يسين (K) (K6، K11، K27، K29، K33، K48 و K63) أو ميثيونين N-الطرفية (M1؛ كما هو معروف باسم الخطي) في ubiquitin السابقة2. بعض من هذه العلامات polyubiquitin هي تدهور محددة (K48)3, في حين أن البعض الآخر مستقلة إلى حد كبير عن عملية تدهور البروتين (M1)4,5,6. وهكذا، فإن عملية انتشار البروتين معقدة بشكل لا يصدق والقدرة على قياس التغيرات في علامة بوليوبيكتين محددة أمر بالغ الأهمية لفهم دور ذلك التعديل في الأداء الخلوي في نهاية المطاف. زيادة تعقيد دراسة هذا النظام، وبروتياسوم، وهو الهيكل الحفاز للUPS7، على حد سواء يتحلل البروتينات ولكن يمكن أيضا أن تشارك في عمليات أخرى غير بروتيوليتيك8،9. ليس من المستغرب بعد ذلك، منذ اكتشافه الأولي، وقد تورط النشاط العادي والشاذ في ubiquitin-proteasome في تكوين الذاكرة على المدى الطويل ومجموعة متنوعة من حالات المرض، بما في ذلك العديد من العصبية، العصبية والنفسية اضطرابات10,11. ونتيجة لذلك، فإن الأساليب التي يمكن أن تحدد بشكل فعال وفعال نشاط UPS في الدماغ حاسمة لفهم في نهاية المطاف كيف يتم تنظيم هذا النظام في حالات المرض والتطوير النهائي لخيارات العلاج التي تستهدف في كل مكان و / أو أداء بروتياسوم.
هناك عدد من القضايا في قياس النشاط في كل مكان بروتيسوم في أنسجة الدماغ من الفئران والفئران، والتي هي النظم النموذجية الأكثر شيوعا المستخدمة لدراسة وظيفة يو بي سي، بما في ذلك 1) تنوع التعديلات ubiquitin، و 2) توزيع و التنظيم التفاضلي لUPS يعمل عبر المقصورات دون الخلوية12،13،14. على سبيل المثال، العديد من المظاهرات المبكرة من وظيفة ubiquitin-بروتياسوم في الدماغ أثناء تكوين الذاكرة تستخدم lysates الخلية بأكملها وأشار إلى زيادات تعتمد على الوقت في كل من البروتين في كل مكان والنشاط بروتياسوم15، 16 سنة , 17 سنة , 18 سنة , 19 سنة , 20.ومع ذلك، وجدنا مؤخرا أن النشاط ubiquitin-proteasome تختلف على نطاق واسع عبر المقصورات دون الخلوية استجابة للتعلم، مع زيادات متزامنة في بعض المناطق والانخفاض في مناطق أخرى، وهو نمط يختلف اختلافا كبيرا من ما تم الإبلاغ عنه سابقا في خلية كاملة lysates21. وهذا يتسق مع الحد من نهج الخلية بأكملها، كما أنه لا يمكن فصل مساهمة التغييرات في نشاط UPS عبر مقصورات دون الخلوية المختلفة. على الرغم من أن الدراسات الحديثة قد استخدمت بروتوكولات الكسور متشابك لدراسة UPS على وجه التحديد في نقاط الاشتباك العصبي استجابة للتعلم22،23،24، والأساليب المستخدمة occlude القدرة على قياس النووية والسيتوبلازمية في كل مكان بروتياسوم التغيرات في نفس الحيوان. وهذا يؤدي إلى حاجة لا لزوم لها لتكرار التجارب عدة مرات، وجمع كسر دون الخلوية مختلفة في كل. وهذا لا يؤدي فقط إلى خسارة أكبر في الأرواح الحيوانية، ولكنه يلغي القدرة على مقارنة نشاط يو بي سي مباشرة عبر مقصورات دون خلوية مختلفة استجابة لحدث معين أو أثناء حالة مرض معين. وبالنظر إلى أن أهداف البروتين من ubiquitin وبروتياسوم تختلف على نطاق واسع في جميع أنحاء الخلية، وفهم كيف يختلف الإشارات ubiquitin-proteasome في مقصورات دون الخلوية متميزة أمر بالغ الأهمية لتحديد الدور الوظيفي للUPS في الدماغ أثناء تكوين الذاكرة والاضطرابات العصبية والعصبية والنفسية.
لتلبية هذه الحاجة، قمنا مؤخرا بتطوير إجراء حيث يمكن جمع الكسور النووية والسيتوبلازمية ومتشابك لمنطقة الدماغ معينة من نفس الحيوان21. بالإضافة إلى ذلك، لحساب كمية محدودة من البروتين التي يمكن الحصول عليها من جمع كسور دون الخلوية متعددة من نفس العينة، ونحن الأمثل البروتوكولات المنشأة سابقا لفحص في المختبر نشاط بروتياسوم والربط محددة البروتين في كل مكان في الخلايا اللمعة التي تم جمعها من أنسجة الدماغ القوارض. باستخدام هذا البروتوكول، تمكنا من جمع ومقارنة مباشرة التغيرات تعتمد على التعلم في النشاط بروتياسوم، K48، K63، M1 ومستويات تعدد النقاط البروتينية الشاملة في النواة والسيتوبلازم وفي نقاط الاشتباك العصبي في اللوزة الجانبية للفئران. هنا، ونحن نصف بالتفصيل إجراءنا ( الشكل1)،والتي يمكن أن تحسن بشكل كبير فهمنا لكيفية مشاركة UPS في تشكيل الذاكرة على المدى الطويل ومختلف حالات المرض. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن النشاط البروتياسوم في المختبر التي نوقشت في بروتوكولنا، على الرغم من استخدامها على نطاق واسع، لا يقيس مباشرة نشاط المجمعات بروتياسوم 26S كاملة. بدلا من ذلك، يقيس هذا الفحص نشاط جوهر 20S، وهذا يعني أنه يمكن أن يكون فقط بمثابة وكيل لفهم نشاط الأساسية نفسها بدلا من مجمع 26S بروتياسوم بأكمله.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا، نقوم بتوضيح طريقة فعالة لتحديد التغيرات في النشاط في كل مكان-بروتياسوم عبر مقصورات تحت الخلوية المختلفة في نفس الحيوان. وفي الوقت الراهن، اقتصرت معظم المحاولات الرامية إلى قياس التغيرات دون الخلوية في نشاط النظام البروتيسوم في كل من يوبيكويتين على مقصورة واحدة لكل عينة، مما أدى إلى …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا العمل من قبل صناديق بدء التشغيل من كلية العلوم الزراعية والحياة وكلية العلوم في فرجينيا للتكنولوجيا.
Materials
| 0.5M EDTA | Fisher | 15575020 | Various other vendors |
| 20S Proteasome Activity Kit | Millipore Sigma | APT280 | Other vendors carry different versions |
| ATP | Fisher | FERR1441 | Various other vendors |
| Beta-actin antibody | Cell signaling | 4967S | Various other vendors |
| Beta-tubulin antibody | Cell signaling | 2128T | Various other vendors |
| BioTek Synergy H1 plate reader | BioTek | VATECHH1MT3 | Other vendors carry different versions |
| B-mercaptoethanol | Fisher | ICN19024280 | Various other vendors |
| clasto lactacystin b-lactone | Millipore Sigma | L7035 | Various other vendors |
| Cryogenic cup | Fisher | 033377B | Various other vendors |
| DMSO | DMSO | D8418 | Varous other vendors |
| DTT | Millipore Sigma | D0632 | Various other vendors |
| Glycerol | Millipore Sigma | G5516 | Various other vendors |
| H3 antibody | Abcam | ab1791 | Various other vendors |
| HEPES | Millipore Sigma | H3375 | Various other vendors |
| Hydrochloric acid | Fisher | SA48 | Various other vendors |
| IGEPAL (NP-40) | Millipore Sigma | I3021 | Various other vendors |
| K48 Ubiquitin Antibody | Abcam | ab140601 | Various other vendors |
| K63 Ubiquitin Antibody | Abcam | ab179434 | Various other vendors |
| KCl | Millipore Sigma | P9541 | Various other vendors |
| KONTES tissue grinder | VWR | KT885300-0002 | Various other vendors |
| Laemmli sample buffer | Bio-rad | 161-0737 | Various other vendors |
| Linear Ubiquitin Antibody | Life Sensors | AB-0130-0100 | Only M1 antibody |
| MgCl | Millipore Sigma | 442611 | Various other vendors |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 2231000213 | Various other manufacturers/models |
| myr-AIP | Enzo Life Sciences | BML-P212-0500 | Carried by Millipore-Sigma |
| NaCl | Millipore Sigma | S3014 | Various other vendors |
| Odyssey Fc Imaging System | LiCor | 2800-02 | Other vendors carry different versions |
| Phosphatase Inhibitor | Millipore Sigma | 524625 | Various other vendors |
| Precision Plus Protein Standard | Bio-rad | 161-0373 | Various other vendors |
| Protease Inhibitor | Millipore Sigma | P8340 | Various other vendors |
| PSD95 antibody | Cell signaling | 3450T | Various other vendors |
| SDS | Millipore Sigma | L3771 | Various other vendors |
| Sodium hydroxide | Fisher | SS255 | Various other vendors |
| Sucrose | Millipore Sigma | S0389 | Various other vendors |
| TBS | Alfa Aesar | J62938 | Varous other vendors |
| Tris | Millipore Sigma | T1503 | Various other vendors |
| Tween-20 | Fisher | BP337-100 | Various other vendors |
| Ubiquitin Antibody | Enzo Life Sciences | BML-PW8810 | Various other vendors |
References
- Hershko, A., Ciechanover, A. The ubiquitin system. Annu Rev Biochem. 67, 425-479 (1998).
- Akutsu, M., Dikic, I., Bremm, A. Ubiquitin chain diversity at a glance. Journal of Cell Science. 129 (5), 875-880 (2016).
- Ravid, T., Hochstrasser, M. Diversity of degradation signals in the ubiquitin-proteasome system. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (9), 679-690 (2008).
- Erpapazoglou, Z., Walker, O., Haguenauer-Tsapis, R. Versatile roles of k63-linked ubiquitin chains in trafficking. Cells. 3 (4), 1027-1088 (2014).
- Iwai, K., Fujita, H., Sasaki, Y. Linear ubiquitin chains: NF-kappaB signalling, cell death and beyond. Nature Review Molecular Cell Biology. 15 (8), 503-508 (2014).
- Rieser, E., Cordier, S. M., Walczak, H. Linear ubiquitination: a newly discovered regulator of cell signalling. Trends in Biochemical Sciences. 38 (2), 94-102 (2013).
- Collins, G. A., Goldberg, A. L. The Logic of the 26S Proteasome. Cell. 169 (5), 792-806 (2017).
- Bhat, K. P., et al. The 19S proteasome ATPase Sug1 plays a critical role in regulating MHC class II transcription. Molecular Immunology. 45 (8), 2214-2224 (2008).
- Ezhkova, E., Tansey, W. P. Proteasomal ATPases link ubiquitylation of histone H2B to methylation of histone H3. Molecular Cell. 13 (3), 435-442 (2004).
- Jarome, T. J., Helmstetter, F. J. The ubiquitin-proteasome system as a critical regulator of synaptic plasticity and long-term memory formation. Neurobiology of Learning and Memory. 105, 107-116 (2013).
- Hegde, A. N., Upadhya, S. C. The ubiquitin-proteasome pathway in health and disease of the nervous system. Trends in Neuroscience. 30 (11), 587-595 (2007).
- Adori, C., et al. Subcellular distribution of components of the ubiquitin-proteasome system in non-diseased human and rat brain. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 54 (2), 263-267 (2006).
- Upadhya, S. C., Ding, L., Smith, T. K., Hegde, A. N. Differential regulation of proteasome activity in the nucleus and the synaptic terminals. Neurochemistry International. 48 (4), 296-305 (2006).
- Enenkel, C., Lehmann, A., Kloetzel, P. M. Subcellular distribution of proteasomes implicates a major location of protein degradation in the nuclear envelope-ER network in yeast. EMBO Journal. 17 (21), 6144-6154 (1998).
- Jarome, T. J., Kwapis, J. L., Ruenzel, W. L., Helmstetter, F. J. CaMKII, but not protein kinase A, regulates Rpt6 phosphorylation and proteasome activity during the formation of long-term memories. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 7, 115 (2013).
- Jarome, T. J., Werner, C. T., Kwapis, J. L., Helmstetter, F. J. Activity dependent protein degradation is critical for the formation and stability of fear memory in the amygdala. PLoS One. 6 (9), e24349 (2011).
- Lopez-Salon, M., et al. The ubiquitin-proteasome cascade is required for mammalian long-term memory formation. European Journal of Neuroscience. 14 (11), 1820-1826 (2001).
- Reis, D. S., Jarome, T. J., Helmstetter, F. J. Memory formation for trace fear conditioning requires ubiquitin-proteasome mediated protein degradation in the prefrontal cortex. Frontiers in Behavior Neuroscience. 7, 150 (2013).
- Rosenberg, T., Elkobi, A., Rosenblum, K. mAChR-dependent decrease in proteasome activity in the gustatory cortex is necessary for novel taste learning. Neurobiology of Learning and Memory. 135, 115-124 (2016).
- Rosenberg, T., Elkobi, A., Dieterich, D. C., Rosenblum, K. NMDAR-dependent proteasome activity in the gustatory cortex is necessary for conditioned taste aversion. Neurobiology of Learning and Memory. 130, 7-16 (2016).
- Orsi, S. A., et al. Distinct subcellular changes in proteasome activity and linkage-specific protein polyubiquitination in the amygdala during the consolidation and reconsolidation of a fear memory. Neurobiology of Learning and Memory. 157, 1-11 (2019).
- Cullen, P. K., Ferrara, N. C., Pullins, S. E., Helmstetter, F. J. Context memory formation requires activity-dependent protein degradation in the hippocampus. Learning and Memory. 24 (11), 589-596 (2017).
- Jarome, T. J., Ferrara, N. C., Kwapis, J. L., Helmstetter, F. J. CaMKII regulates proteasome phosphorylation and activity and promotes memory destabilization following retrieval. Neurobiology of Learning and Memory. 128, 103-109 (2016).
- Lee, S. H., et al. Synaptic protein degradation underlies destabilization of retrieved fear memory. Science. 319 (5867), 1253-1256 (2008).
- Dunah, A. W., Standaert, D. G. Dopamine D1 receptor-dependent trafficking of striatal NMDA glutamate receptors to the postsynaptic membrane. Journal of Neuroscience. 21 (15), 5546-5558 (2001).
- Kelly, P. T., Cotman, C. W. Synaptic proteins. Characterization of tubulin and actin and identification of a distinct postsynaptic density polypeptide. Journal of Cell Biology. 79 (1), 173-183 (1978).
- Mengual, E., Arizti, P., Rodrigo, J., Gimenez-Amaya, J. M., Castano, J. G. Immunohistochemical distribution and electron microscopic subcellular localization of the proteasome in the rat CNS. Journal of Neuroscience. 16 (20), 6331-6341 (1996).
