Quantifizierung subzellulärer Ubiquitin-Proteasom-Aktivität im Nagetierhirn
Summary
Dieses Protokoll wurde entwickelt, um die Aktivität des Ubiquitin-Proteasom-Systems (UPS) in verschiedenen zellulären Kompartimenten des Nagetierhirns effizient zu quantifizieren. Anwender sind in der Lage, die USB-Funktion in nuklearen, zytoplasmatischen und synaptischen Fraktionen bei demselben Tier zu untersuchen, wodurch die Zeit und Anzahl der Tiere, die für die Durchführung dieser komplexen Analysen benötigt werden, reduziert wird.
Abstract
Das Ubiquitin-Proteasom-System ist ein wichtiger Regulator des Proteinabbaus und einer Vielzahl anderer zellulärer Prozesse in Eukaryoten. Im Gehirn, Erhöhung enrubisiert-proteasom Aktivität sind entscheidend für synaptische Plastizität und Gedächtnisbildung und aberrante Veränderungen in diesem System sind mit einer Vielzahl von neurologischen, neurodegenerativen und psychiatrischen Störungen verbunden. Eines der Probleme bei der Untersuchung der Ubiquitin-Proteasom-Funktion im Gehirn ist, dass es in allen zellulären Kompartimenten vorhanden ist, in denen die Proteinziele, die funktionelle Rolle und die Regulationsmechanismen sehr unterschiedlich sein können. Infolgedessen ist die Fähigkeit, das Gehirn-Ubiquitin-Protein-Targeting und die katalytische Aktivität des Proteasomen in verschiedenen subzellulären Kompartimenten innerhalb desselben Tieres direkt zu vergleichen, entscheidend für das vollständige Verständnis, wie die USV zur synaptischen Plastizität beiträgt. Gedächtnis und Krankheit. Die hier beschriebene Methode ermöglicht die Entnahme von kerntechnischen, zytoplasmatischen und rohen synaptischen Fraktionen aus demselben Nagetier (Ratten)-Gehirn, gefolgt von einer gleichzeitigen Quantifizierung der proteasomkatalytischen Aktivität (indirekt, die Aktivität des Proteasomkerns bereitstellt). ) und linkage-spezifische Ubiquitin-Protein-Tagging. So kann die Methode verwendet werden, um subzelluläre Veränderungen in der Ubiquitin-Proteasom-Aktivität in verschiedenen Hirnregionen im selben Tier während der synaptischen Plastizität, Gedächtnisbildung und verschiedenen Krankheitszuständen direkt zu vergleichen. Diese Methode kann auch verwendet werden, um die subzelluläre Verteilung und Funktion anderer Proteine innerhalb desselben Tieres zu bewerten.
Introduction
Das Ubiquitin-Proteasom-System (UPS) ist ein komplexes Netzwerk miteinander verbundener Proteinstrukturen und Ligasen, das den Abbau der meisten kurzlebigen Proteine in Zellen1steuert. In diesem System werden Proteine durch den kleinen Modifikator Ubiquitin für Abbau oder andere zelluläre Prozesse/Fates markiert. Ein Zielprotein kann 1-7 Ubiquitin-Modifikationen erwerben, die an einem von sieben Lysin(K)-Standorten (K6, K11, K27, K29, K33, K48 und K63) oder dem N-Terminal Methionin (M1; bekannt als linear) im vorherigen Ubiquitin2miteinander verknüpft werden können. Einige dieser Polyubiquitin-Tags sind abbauspezifisch (K48)3, während andere weitgehend unabhängig vom Proteinabbauprozess (M1)4,5,6sind. Daher ist der Protein-Ubiquitinationsprozess unglaublich komplex und die Fähigkeit, Veränderungen in einem bestimmten Polyubiquitin-Tag zu quantifizieren, ist entscheidend für das letztendliche Verständnis der Rolle dieser gegebenen Veränderung in der zellulären Funktion. Erschwerend kommt hinzu, dass die Untersuchung dieses Systems, das Proteasom,die katalytische Struktur der USV 7, sowohl Proteine abbaut, als auch aber auch an anderen nicht-proteolytischen Prozessen beteiligt sein kann8,9. Es überrascht nicht, dass seit seiner ersten Entdeckung eine normale und abnorme ubiquitin-proteasomische Aktivität in die Langzeitgedächtnisbildung und eine Vielzahl von Krankheitszuständen verwickelt ist, darunter viele neurologische, neurodegenerative und psychiatrische Störungen10,11. Infolgedessen sind Methoden, die die USS-Aktivität im Gehirn effektiv und effizient quantifizieren können, entscheidend für das letztendliche Verständnis, wie dieses System in Krankheitszuständen dysreguliert ist, und die letztendliche Entwicklung von Behandlungsmöglichkeiten, die auf Ubiquitin und/oder proteasom funktionadieren.
Es gibt eine Reihe von Problemen bei der Quantifizierung der Ubiquitin-Proteasom-Aktivität im Hirngewebe von Ratten und Mäusen, die die häufigsten Modellsysteme sind, die verwendet werden, um die UPS-Funktion zu untersuchen, einschließlich 1) die Vielfalt der Ubiquitin-Modifikationen und 2) Die Verteilung und Differenzregelung der USUs-Funktion über subzelluläre Kompartimente12,13,14. Zum Beispiel verwendeten viele der frühen Demonstrationen der Ubiquitin-Proteasom-Funktion im Gehirn während der Gedächtnisbildung ganze Zelllysate und deuteten auf eine zeitabhängige Zunahme sowohl der Protein-Ubiquitination als auch der Proteasomenaktivität15, 16 , 17 , 18 , 19 , 20. Vor kurzem stellten wir jedoch fest, dass die Ubiquitin-Proteasomen-Aktivität in den subzellulären Fächern als Reaktion auf das Lernen sehr unterschiedlich war, wobei in einigen Regionen gleichzeitig zunimmt und in anderen ein Muster abnimmt, das sich erheblich unterscheidet. von dem, was zuvor in ganzen Zelllysaten berichtet wurde21. Dies steht im Einklang mit der Einschränkung eines gesamten Zellansatzes, da er den Beitrag von Änderungen der USB-Aktivität über verschiedene subzelluläre Kompartimente hinweg nicht trennen kann. Obwohl neuere Studien synaptische Bruchprotokolle verwendet haben, um die USV speziell an Synapsen als Reaktion auf das Lernen22,23,24zu studieren, schließen die angewandten Methoden die Fähigkeit zur Messung kerntechnische und zytoplasmatische Ubiquitin-Proteasom-Veränderungen im selben Tier. Dies führt zu einer unnötigen Notwendigkeit, Experimente mehrmals zu wiederholen, wobei jeweils eine andere subzelluläre Fraktion gesammelt wird. Dies führt nicht nur zu einem größeren Verlust von Tierleben, sondern eliminiert auch die Möglichkeit, DIE USV-Aktivität in verschiedenen subzellulären Abteilungen als Reaktion auf ein bestimmtes Ereignis oder während eines bestimmten Krankheitszustands direkt zu vergleichen. Wenn man bedenkt, dass die Proteinziele von Ubiquitin und dem Proteasom in der Zelle sehr unterschiedlich sind, ist es entscheidend zu verstehen, wie sich die Ubiquitin-Proteasome-Signalisierung in verschiedenen subzellulären Kompartimenten unterscheidet, um die funktionelle Rolle der USB in der Gedächtnisbildung und neurologische, neurodegenerative und psychiatrische Störungen.
Um diesem Bedarf gerecht zu werden, haben wir vor kurzem ein Verfahren entwickelt, bei dem kerntechnische, zytoplasmatische und synaptische Fraktionen für eine bestimmte Hirnregion desselben Tieres gesammelt werden könnten21. Um die begrenzte Menge an Protein zu berücksichtigen, die aus der Entnahme mehrerer subzellulärer Fraktionen aus derselben Probe gewonnen werden kann, haben wir zuvor etablierte Protokolle optimiert, um die In-vitro-Proteasomaktivität und die linkage-spezifische Protein-Ubiquitination in lysierten Zellen aus Nagetier-Gehirngewebe gesammelt. Mit diesem Protokoll konnten wir lernabhängige Veränderungen der Proteasomaktivität K48, K63, M1 und der gesamten Proteinpolyubiquitination im Kern und Zytoplasma sowie an Synapsen in der lateralen Amygdala von Ratten sammeln und direkt vergleichen. Hier beschreiben wir detailliert unser Verfahren (Abbildung 1), das unser Verständnis davon, wie die USV an der Langzeitgedächtnisbildung und verschiedenen Krankheitszuständen beteiligt ist, erheblich verbessern könnte. Es sollte jedoch darauf hingewiesen werden, dass die in unserem Protokoll diskutierte In-vitro-Proteasomaktivität zwar weit verbreitet ist, aber die Aktivität vollständiger 26S-Proteasomkomplexe nicht direkt misst. Vielmehr misst dieser Assay die Aktivität des 20S-Kerns, d. h. er kann nur als Proxy dienen, um die Aktivität des Kerns selbst im Gegensatz zum gesamten 26S-Proteasom-Komplex zu verstehen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier zeigen wir eine effiziente Methode zur Quantifizierung von Veränderungen der Ubiquitin-Proteasom-Aktivität in verschiedenen subzellulären Kompartimenten im selben Tier. Derzeit sind die meisten Versuche zur Messung subzellulärer Aktivitätsänderungen des Ubiquitin-Proteasom-Systems auf ein einziges Fach pro Probe beschränkt, was dazu führt, dass Experimente wiederholt werden müssen. Dies führt zu erheblichen Kosten und Verlusten an Tierleben. Unser Protokoll lindert dieses Problem, indem es Hemisphären spa…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Start-up-Fonds des College of Agricultural and Life Sciences und des College of Science an der Virginia Tech unterstützt. T.M. wird vom George Washington Carver Program an der Virginia Tech unterstützt.
Materials
| 0.5M EDTA | Fisher | 15575020 | Various other vendors |
| 20S Proteasome Activity Kit | Millipore Sigma | APT280 | Other vendors carry different versions |
| ATP | Fisher | FERR1441 | Various other vendors |
| Beta-actin antibody | Cell signaling | 4967S | Various other vendors |
| Beta-tubulin antibody | Cell signaling | 2128T | Various other vendors |
| BioTek Synergy H1 plate reader | BioTek | VATECHH1MT3 | Other vendors carry different versions |
| B-mercaptoethanol | Fisher | ICN19024280 | Various other vendors |
| clasto lactacystin b-lactone | Millipore Sigma | L7035 | Various other vendors |
| Cryogenic cup | Fisher | 033377B | Various other vendors |
| DMSO | DMSO | D8418 | Varous other vendors |
| DTT | Millipore Sigma | D0632 | Various other vendors |
| Glycerol | Millipore Sigma | G5516 | Various other vendors |
| H3 antibody | Abcam | ab1791 | Various other vendors |
| HEPES | Millipore Sigma | H3375 | Various other vendors |
| Hydrochloric acid | Fisher | SA48 | Various other vendors |
| IGEPAL (NP-40) | Millipore Sigma | I3021 | Various other vendors |
| K48 Ubiquitin Antibody | Abcam | ab140601 | Various other vendors |
| K63 Ubiquitin Antibody | Abcam | ab179434 | Various other vendors |
| KCl | Millipore Sigma | P9541 | Various other vendors |
| KONTES tissue grinder | VWR | KT885300-0002 | Various other vendors |
| Laemmli sample buffer | Bio-rad | 161-0737 | Various other vendors |
| Linear Ubiquitin Antibody | Life Sensors | AB-0130-0100 | Only M1 antibody |
| MgCl | Millipore Sigma | 442611 | Various other vendors |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 2231000213 | Various other manufacturers/models |
| myr-AIP | Enzo Life Sciences | BML-P212-0500 | Carried by Millipore-Sigma |
| NaCl | Millipore Sigma | S3014 | Various other vendors |
| Odyssey Fc Imaging System | LiCor | 2800-02 | Other vendors carry different versions |
| Phosphatase Inhibitor | Millipore Sigma | 524625 | Various other vendors |
| Precision Plus Protein Standard | Bio-rad | 161-0373 | Various other vendors |
| Protease Inhibitor | Millipore Sigma | P8340 | Various other vendors |
| PSD95 antibody | Cell signaling | 3450T | Various other vendors |
| SDS | Millipore Sigma | L3771 | Various other vendors |
| Sodium hydroxide | Fisher | SS255 | Various other vendors |
| Sucrose | Millipore Sigma | S0389 | Various other vendors |
| TBS | Alfa Aesar | J62938 | Varous other vendors |
| Tris | Millipore Sigma | T1503 | Various other vendors |
| Tween-20 | Fisher | BP337-100 | Various other vendors |
| Ubiquitin Antibody | Enzo Life Sciences | BML-PW8810 | Various other vendors |
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