Rodent मस्तिष्क में Subcellular Ubicuitin-proteasome गतिविधि की मात्रा
Summary
इस प्रोटोकॉल को कृंतक मस्तिष्क के विभिन्न सेलुलर डिब्बों में सर्वव्यापक-प्रोटेसोम सिस्टम (यूपीएस) गतिविधि को कुशलतापूर्वक परिमाणित करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। उपयोगकर्ताओं को एक ही जानवर में परमाणु, साइटोप्लाज्मिक और synaptic भिन्न में यूपीएस कार्य की जांच करने में सक्षम हैं, समय और इन जटिल विश्लेषण करने के लिए आवश्यक जानवरों की संख्या की मात्रा को कम करने.
Abstract
सर्वव्यापक प्रणाली प्रोटीन अवक्रमण का एक प्रमुख नियामक है और यूकैरियोट में विभिन्न प्रकार की अन्य सेलुलर प्रक्रियाओं है। मस्तिष्क में, सर्वव्यापक गतिविधि में वृद्धि synaptic प्लास्टिक और स्मृति गठन के लिए महत्वपूर्ण हैं और इस प्रणाली में aberant परिवर्तन तंत्रिका संबंधी, neurodegenerative और मनोरोग विकारों की एक किस्म के साथ जुड़े रहे हैं. मस्तिष्क में सर्वव्यापक-प्रोटेसोम कामकाज के अध्ययन में मुद्दों में से एक यह है कि यह सभी सेलुलर डिब्बों में मौजूद है, जिसमें प्रोटीन लक्ष्य, कार्यात्मक भूमिका और विनियमन के तंत्र व्यापक रूप से भिन्न हो सकते हैं। एक परिणाम के रूप में, सीधे एक ही जानवर के भीतर विभिन्न subcellular डिब्बों में मस्तिष्क सर्वव्यापक प्रोटीन लक्ष्यीकरण और proteasome उत्प्रेरक गतिविधि की तुलना करने की क्षमता पूरी तरह से समझ कैसे यूपीएस synaptic प्लास्टिक के लिए योगदान देता है के लिए महत्वपूर्ण है, स्मृति और रोग. यहाँ वर्णित विधि एक ही कृंतक (राट) मस्तिष्क से परमाणु, साइटोप्लाज्मिक और कच्चे synaptic भिन्नों के संग्रह की अनुमति देता है, proteasome उत्प्रेरक गतिविधि के एक साथ परिमाणीकरण के बाद (अप्रत्यक्ष रूप से, proteasome कोर की गतिविधि प्रदान केवल) और लिंकेज-विशिष्ट सर्वव्यापक प्रोटीन टैगिंग। इस प्रकार, विधि synaptic प्लास्टिक, स्मृति गठन और विभिन्न रोग राज्यों के दौरान एक ही जानवर में विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्रों में सर्वव्यापक-प्रोटेसोम गतिविधि में subcellular परिवर्तन की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस विधि का उपयोग एक ही जानवर के भीतर अन्य प्रोटीनों के उपकोशिकीय वितरण और कार्य का आकलन करने के लिए भी किया जा सकता है।
Introduction
सर्वव्यापक प्रणाली (यूपीएस) परस्पर प्रोटीन संरचनाओं और ligases का एक जटिल नेटवर्क है कि कोशिकाओं1में सबसे कम रहते प्रोटीन की गिरावट को नियंत्रित करता है. इस प्रणाली में, प्रोटीन गिरावट या अन्य सेलुलर प्रक्रियाओं के लिए चिह्नित कर रहे हैं / एक लक्ष्य प्रोटीन 1-7 सबबीक्विटिन संशोधन प्राप्त कर सकते हैं, जो सात लाइसिन (K) साइटों में से एक पर एक साथ लिंक कर सकते हैं (K6, K11, K27, K29, K33, K48 और K63) या N-terminal methionine (M1; रैखिक के रूप में जाना जाता है) पिछले सर्वव्यापकमें से2. इनमें से कुछ पॉलीयूबिक्विटिन टैग निम्नीकरण-विशिष्ट (K48)3हैं, जबकि अन्य प्रोटीन अवक्रमण प्रक्रिया (एम 1) 4,5,6से काफी हद तक स्वतंत्र हैं। इस प्रकार, प्रोटीन सर्वव्यापकता प्रक्रिया अविश्वसनीय रूप से जटिल है और एक विशिष्ट पॉलीयुबिक्विटिन टैग में परिवर्तन की मात्रा निर्धारित करने की क्षमता अंततः सेलुलर कामकाज में दिए गए संशोधन की भूमिका को समझने के लिए महत्वपूर्ण है। इस प्रणाली के अध्ययन को और जटिल बनाते हुए, प्रोटीसोम, जो यूपीएस7की उत्प्रेरक संरचना है, दोनों प्रोटीन को कम कर देते हैं लेकिन अन्य गैर-प्रोटीओलिटिक प्रक्रियाओं8,9में भी शामिल किए जा सकते हैं। आश्चर्य की बात नहीं है तो, अपनी प्रारंभिक खोज के बाद से, सामान्य और aberant सर्वव्यापक-प्रोटीसम गतिविधि दीर्घकालिक स्मृति गठन और रोग राज्यों की एक किस्म में फंसाया गया है, कई न्यूरोलॉजिकल सहित, neurodegenerative और मनोरोग विकार10,11. एक परिणाम के रूप में, तरीकों जो प्रभावी ढंग से और कुशलता से मस्तिष्क में यूपीएस गतिविधि की मात्रा निर्धारित कर सकते हैं अंततः समझ कैसे इस प्रणाली रोग राज्यों में disregulated है और उपचार विकल्प सर्वव्यापकता को लक्षित करने के अंतिम विकास के लिए महत्वपूर्ण हैं और / प्रोटीसोम कामकाज।
चूहों और चूहों से मस्तिष्क के ऊतकों में सर्वव्यापकता-प्रोटेसोम गतिविधि को परिमाणित करने में कई मुद्दे हैं, जो यूपीएस फ़ंक्शन का अध्ययन करने के लिए सबसे आम मॉडल सिस्टम हैं, जिसमें 1) सर्वव्यापक संशोधनों की विविधता, और 2) वितरण और उपकोशिकीय डिब्बों में कार्यरत यूपीएस का विभेदक विनियमन12,13,14. उदाहरण के लिए, स्मृति निर्माण के दौरान मस्तिष्क में सर्वव्यापक-प्रोटेसोम समारोह के प्रारंभिक प्रदर्शनों में से कई ने पूरे सेल lysates का उपयोग किया और संकेत दिया कि प्रोटीन सर्वव्यापकता और प्रोटीसोम गतिविधि15, दोनों में समय पर निर्भर वृद्धि हुई है, 16 , 17 , 18 , 19 , 20.तथापि, हमने हाल ही में पाया कि सबबाक्विटिन-प्रोटीसोम गतिविधि सीखने के जवाब में उपकोशिकीय डिब्बों में व्यापक रूप से भिन्न होती है, कुछ क्षेत्रों में एक साथ वृद्धि होती है और दूसरों में घटती है, एक पैटर्न जो काफी अलग होता है से क्या पहले पूरे सेल lysates21में बताया गया था . यह एक पूरे सेल दृष्टिकोण की सीमा के अनुरूप है, क्योंकि यह विभिन्न उपकोशिकीय डिब्बों में यूपीएस गतिविधि में परिवर्तन के योगदान को अलग नहीं कर सकता। हालांकि हाल के अध्ययनों ने22,23,24, 24 को सीखने के जवाब में विशेष रूप से यूपीएस में यूपीएस का अध्ययन करने के लिए synaptic भिन्न प्रोटोकॉल का प्रयोग किया है , तरीकों को मापने की क्षमता का इस्तेमाल किया नाभिकीय और कोशिकाद्रव्यी सर्वव्यापकता एक ही जानवर में परिवर्तन। यह एक अनावश्यक प्रयोगों को दोहराने के लिए कई बार की जरूरत में परिणाम, प्रत्येक में एक अलग subcellular अंश इकट्ठा. न केवल पशु जीवन का एक बड़ा नुकसान में इस परिणाम है, लेकिन यह सीधे किसी दिए गए घटना के जवाब में या एक विशिष्ट रोग राज्य के दौरान विभिन्न subcellular डिब्बों में यूपीएस गतिविधि की तुलना करने की क्षमता समाप्त. यह देखते हुए कि सबबक्विटीन के प्रोटीन लक्ष्य और प्रोटीसोम पूरे सेल में व्यापक रूप से भिन्न होते हैं, यह समझते हुए कि कैसे सबबाक्विटिन-प्रोटेसोम संकेतन अलग-अलग उपकोशिकीय डिब्बों में अलग-अलग है, यूपीएस की कार्यात्मक भूमिका की पहचान करने के लिए महत्वपूर्ण है स्मृति गठन और तंत्रिका विज्ञान, neurodegenerative और मनोरोग विकारों के दौरान मस्तिष्क.
इस आवश्यकता को पूरा करने के लिए हमने हाल ही में एक प्रक्रिया विकसित की है जिसमें एक ही पशु21से दिए गए मस्तिष्क क्षेत्र के लिए परमाणु, कोशिकाद्रव्यी और synaptic भिन्न एकत्र किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, प्रोटीन की सीमित मात्रा है कि एक ही नमूना से कई subcellular अंश इकट्ठा करने से प्राप्त किया जा सकता है के लिए खाते में, हम पहले से स्थापित प्रोटोकॉल अनुकूलित इन विट्रो proteasome गतिविधि और लिंकेज-विशिष्ट में परख करने के लिए कृंतक मस्तिष्क ऊतक से एकत्र lysed कोशिकाओं में प्रोटीन सर्वव्यापकन. इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, हम इकट्ठा करने और सीधे proteasome गतिविधि में सीखने पर निर्भर परिवर्तन की तुलना करने में सक्षम थे, K48, K63, M1 और समग्र प्रोटीन polyubicuitination स्तर नाभिक और कोशिका द्रव्य में और चूहों के पार्श्व amygdala में synapses में. यहाँ, हम विस्तार से हमारी प्रक्रिया का वर्णन (चित्र1), जो काफी यूपीएस दीर्घकालिक स्मृति गठन और विभिन्न रोग राज्यों में शामिल है की हमारी समझ में सुधार सकता है. हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि इन विट्रो proteasome गतिविधि हमारे प्रोटोकॉल में चर्चा की, जबकि व्यापक रूप से इस्तेमाल किया, सीधे पूरा 26S proteasome परिसरों की गतिविधि को मापने नहीं है. बल्कि, इस परख 20S कोर की गतिविधि के उपाय, जिसका अर्थ यह केवल एक प्रॉक्सी के रूप में सेवा करने के लिए कोर ही की गतिविधि को समझने के रूप में पूरे 26S proteasome परिसर का विरोध कर सकते हैं.
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ, हम एक ही जानवर में विभिन्न subcellular डिब्बों में सर्वव्यापक गतिविधि में परिवर्तन की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक कुशल विधि का प्रदर्शन. वर्तमान में, सर्वव्यापक प्रणाली की गतिविधि में उपकोशिकीय पर?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम कृषि और जीवन विज्ञान के कॉलेज से स्टार्टअप धन द्वारा समर्थित था और वर्जीनिया टेक में विज्ञान के कॉलेज T.M. वर्जीनिया टेक में जॉर्ज वाशिंगटन Carver कार्यक्रम द्वारा समर्थित है.
Materials
| 0.5M EDTA | Fisher | 15575020 | Various other vendors |
| 20S Proteasome Activity Kit | Millipore Sigma | APT280 | Other vendors carry different versions |
| ATP | Fisher | FERR1441 | Various other vendors |
| Beta-actin antibody | Cell signaling | 4967S | Various other vendors |
| Beta-tubulin antibody | Cell signaling | 2128T | Various other vendors |
| BioTek Synergy H1 plate reader | BioTek | VATECHH1MT3 | Other vendors carry different versions |
| B-mercaptoethanol | Fisher | ICN19024280 | Various other vendors |
| clasto lactacystin b-lactone | Millipore Sigma | L7035 | Various other vendors |
| Cryogenic cup | Fisher | 033377B | Various other vendors |
| DMSO | DMSO | D8418 | Varous other vendors |
| DTT | Millipore Sigma | D0632 | Various other vendors |
| Glycerol | Millipore Sigma | G5516 | Various other vendors |
| H3 antibody | Abcam | ab1791 | Various other vendors |
| HEPES | Millipore Sigma | H3375 | Various other vendors |
| Hydrochloric acid | Fisher | SA48 | Various other vendors |
| IGEPAL (NP-40) | Millipore Sigma | I3021 | Various other vendors |
| K48 Ubiquitin Antibody | Abcam | ab140601 | Various other vendors |
| K63 Ubiquitin Antibody | Abcam | ab179434 | Various other vendors |
| KCl | Millipore Sigma | P9541 | Various other vendors |
| KONTES tissue grinder | VWR | KT885300-0002 | Various other vendors |
| Laemmli sample buffer | Bio-rad | 161-0737 | Various other vendors |
| Linear Ubiquitin Antibody | Life Sensors | AB-0130-0100 | Only M1 antibody |
| MgCl | Millipore Sigma | 442611 | Various other vendors |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 2231000213 | Various other manufacturers/models |
| myr-AIP | Enzo Life Sciences | BML-P212-0500 | Carried by Millipore-Sigma |
| NaCl | Millipore Sigma | S3014 | Various other vendors |
| Odyssey Fc Imaging System | LiCor | 2800-02 | Other vendors carry different versions |
| Phosphatase Inhibitor | Millipore Sigma | 524625 | Various other vendors |
| Precision Plus Protein Standard | Bio-rad | 161-0373 | Various other vendors |
| Protease Inhibitor | Millipore Sigma | P8340 | Various other vendors |
| PSD95 antibody | Cell signaling | 3450T | Various other vendors |
| SDS | Millipore Sigma | L3771 | Various other vendors |
| Sodium hydroxide | Fisher | SS255 | Various other vendors |
| Sucrose | Millipore Sigma | S0389 | Various other vendors |
| TBS | Alfa Aesar | J62938 | Varous other vendors |
| Tris | Millipore Sigma | T1503 | Various other vendors |
| Tween-20 | Fisher | BP337-100 | Various other vendors |
| Ubiquitin Antibody | Enzo Life Sciences | BML-PW8810 | Various other vendors |
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