설치류 뇌의 세포외 유비퀴틴-프로테아솜 활동 정량화
Summary
이 프로토콜은 설치류 뇌의 다른 세포 구획에서 유비퀴틴-프로테아좀 시스템(UPS) 활성을 효율적으로 정량화하도록 설계되었습니다. 사용자는 동일한 동물의 핵, 세포질 및 시냅스 분획에서 작동하는 UPS를 검사하여 이러한 복잡한 분석을 수행하는 데 필요한 동물의 수와 시간을 줄일 수 있습니다.
Abstract
유비퀴틴-프로테아좀 시스템은 진핵생물의 단백질 분해 및 기타 다양한 세포 과정의 주요 조절제입니다. 뇌에서, 유비퀴틴-프로테아좀 활동의 증가는 시냅스 가소성 및 기억 형성에 매우 중요하며, 이 시스템의 비정상적인 변화는 다양한 신경학적, 퇴행성 및 정신 장애와 관련이 있다. 두뇌에 있는 기능을 유비퀴틴 proteasome 공부에 있는 문제점의 한가지는 단백질 표적, 기능적인 역할 및 규칙의 기계장치가 넓게 변화할 수 있는 모든 세포 구획에 존재한다는 것입니다. 그 결과, 동일한 동물 내의 다른 세포 내 구획에서 뇌 유비퀴틴 단백질 표적화 및 프로테아좀 촉매 활성을 직접 비교하는 능력은 UPS가 시냅스 가소성에 기여하는 방법을 완전히 이해하는 데 매우 중요합니다. 기억력과 질병을 앓고 있습니다. 여기에 설명된 방법은 동일한 설치류(쥐) 뇌에서 핵, 세포질 및 조시냅스 분획을 수집한 다음 프로테아좀 촉매 활성의 동시 정량화(간접적으로 프로테아좀 코어의 활성 제공)를 허용합니다. 만) 및 링키지 특이적 유비퀴틴 단백질 태깅. 따라서, 이 방법은 시냅스 가소성, 기억 형성 및 상이한 질병 상태 동안 동일한 동물의 상이한 뇌 영역에서의 유비퀴틴-프로테아좀 활성의 세포내 변화를 직접 비교하는데 사용될 수 있다. 이 방법은 또한 동일한 동물 내의 다른 단백질의 세포내 분포 및 기능을 평가하는데 사용될 수 있다.
Introduction
유비퀴틴-프로테아좀 시스템(UPS)은 세포 1에서 대부분의 수명이 짧은 단백질의 분해를 제어하는 상호 연결된 단백질구조및 리가제의 복잡한 네트워크입니다. 이 시스템에서, 단백질은 작은 수정기 유비퀴틴에 의해 분해 또는 다른 세포 과정 / 운명에 대한 표시되어 있습니다. 표적 단백질은 7개의 리신(K) 부위(K6, K11, K27, K29, K33, K48 및 K63) 또는 이전 유비퀴틴 2에서 N-말단 메티오닌(M1; 선형으로 알려진) 중하나에서 함께 연결할 수 있는 1-7 유비퀴틴 변형을 획득할 수 있다. 이들 폴리비퀴틴 태그 중 일부는 분해 특이적(K48) 3이며, 다른 것들은 단백질 분해 과정(M1)4,5,6과크게 독립적이다. 따라서, 단백질 유비퀴틴화 과정은 믿을 수 없을 만큼 복잡하며 특정 폴리유비퀴틴 태그의 변화를 정량화하는 능력은 궁극적으로 세포 기능의 변형이 주어진 역할을 이해하는 데 매우 중요하다. 이 시스템의 연구를 더욱 복잡하게 하는, 프로테아좀은 UPS 7의 촉매구조인데, 둘 다 단백질을 저하시키지만 또한 다른 비단백질분해 과정에 관여할 수 있다8,9. 당연히 그 때, 그것의 처음 발견 부터, 정상 및 비정상적인 유비퀴틴-proteasome 활동은 많은 신경학상, 신경 퇴행성 및 정신병학을 포함하여 장기 기억 형성 및 각종 질병 국가에 연루되었습니다 장애10,11. 그 결과, 뇌에서 UPS 활동을 효과적이고 효율적으로 정량화할 수 있는 방법은 궁극적으로 이 시스템이 질병 상태에서 어떻게 dysregulated되는지 이해하고 유비퀴틴 및/또는 프로테아좀 기능.
쥐와 마우스에서 뇌 조직에서 유비퀴틴-프로테아솜 활성을 정량화하는 데 많은 문제가 있는데, 이는 1) 유비퀴틴 수정의 다양성, 및 2) 분포 및 세포 외 구획에 걸쳐 작동하는 UPS의 차동 조절12,13,14. 예를 들어, 기억 형성 동안 뇌에서 유비퀴틴-프로테아좀 기능의 초기 많은 데모는 전체 세포 용해및 단백질 유비퀴틴화 및 프로테아좀 활성 모두에서 시간 의존적 증가를 나타내었으며,15, 16세 , 17세 , 18세 , 19세 , 20. 그러나, 우리는 최근에 유비퀴틴 – proteasome 활동이 학습에 대한 응답으로 세포 외 구획에 걸쳐 광범위하게 변화한다는 것을 발견했으며, 일부 지역에서는 동시 증가와 다른 지역의 감소, 크게 다른 패턴이 있습니다. 이전에 전체 세포에서 보고 된 것에서21. 이것은 다른 세포 구획에 걸쳐 UPS 활동의 변화의 기여를 해리 할 수 없기 때문에 전체 세포 접근법의 한계와 일치합니다. 최근 연구는 학습에 대한 응답으로 시냅스에서 특히 UPS를 연구하기 위해 시냅스 분획 프로토콜을 채택했지만22,23,24,사용되는 방법은 측정 할 수있는 능력을 폐색 같은 동물에 핵 및 세포질 유비퀴틴 – 프로 테아좀 변화. 이로 인해 불필요한 실험을 여러 번 반복하여 각각다른 세포내 분획을 수집해야 합니다. 이것은 동물의 생명을 더 큰 손실귀착할 뿐 아니라, 주어진 사건에 응하여 다른 세포 외 구획에 걸쳐 UPS 활동을 직접 비교하는 기능을 제거하거나 특정 질병 상태 도중. 유비퀴틴과 프로테아좀의 단백질 표적이 세포 전체에 걸쳐 광범위하게 다르다는 점을 고려할 때, 유비퀴틴-프로테아좀 신호가 뚜렷한 세포외 구획에서 어떻게 다른지 이해하는 것은 UPS의 기능적 역할을 식별하는 데 매우 중요합니다. 기억 형성 및 신경 학 동안 뇌, 신경 퇴행 성 및 정신 장애.
이러한 필요성을 해결하기 위해, 우리는 최근에 핵, 세포질 및 시냅스 분획이 동일한 동물21에서주어진 뇌 영역에 대해 수집 될 수있는 절차를 개발했습니다. 또한 동일한 샘플에서 여러 세포 외 분획을 수집하여 얻을 수 있는 제한된 양의 단백질을 고려하여 이전에 확립된 프로토콜을 최적화하여 시험관내 프로테아좀 활성 및 연계 성 활성을 분석했습니다. 설치류 뇌 조직에서 수집 된 lysed 세포에서 단백질 유비퀴틴. 이 프로토콜을 사용하여, 우리는 쥐의 측측 편도체에서 핵과 세포질및 시냅스에서 proteasome 활성, K48, K63, M1 및 전반적인 단백질 폴리유비퀴틴화 수준에서 학습 의존적 변화를 수집하고 직접 비교할 수 있었습니다. 여기에서는 UPS가 장기 기억 형성 및 다양한 질병 상태에 어떻게 관여하는지에 대한 이해를 크게 향상시킬 수 있는 절차(그림 1)를 자세히 설명합니다. 그러나, 당사의 프로토콜에서 논의된 시험관 내 프로테아솜 활성은 널리 사용되고 있지만, 완전한 26S 프로테아솜 복합체의 활성을 직접적으로 측정하지 않는다는 점에 유의해야 한다. 오히려, 이 분석은 20S 코어의 활성을 측정하며, 이는 전체 26S 프로테아솜 컴플렉스와 는 반대로 코어 자체의 활동을 이해하는 프록시역할을 할 수 밖에 없다는 것을 의미합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에서, 우리는 동일 동물에 있는 다른 세포 내 구획에 걸쳐 유비퀴틴-proteasome 활동의 변경을 정량화하는 효율적인 방법을 보여줍니다. 현재, 유비퀴틴-프로테아좀 시스템의 활성에서 세포외 변화를 측정하는 대부분의 시도는 샘플당 단일 구획으로 제한되어 실험을 반복할 필요가 있다. 이것은 상당한 비용과 동물의 생명의 손실로 이어집니다. 우리의 프로토콜은 반구를 분할하여이 문제를 완?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 농업 및 생명 과학 대학의 시작 기금에 의해 지원되었다 버지니아 공대에서 과학 대학. T.M.는 버지니아 공대의 조지 워싱턴 카버 프로그램에 의해 지원됩니다.
Materials
| 0.5M EDTA | Fisher | 15575020 | Various other vendors |
| 20S Proteasome Activity Kit | Millipore Sigma | APT280 | Other vendors carry different versions |
| ATP | Fisher | FERR1441 | Various other vendors |
| Beta-actin antibody | Cell signaling | 4967S | Various other vendors |
| Beta-tubulin antibody | Cell signaling | 2128T | Various other vendors |
| BioTek Synergy H1 plate reader | BioTek | VATECHH1MT3 | Other vendors carry different versions |
| B-mercaptoethanol | Fisher | ICN19024280 | Various other vendors |
| clasto lactacystin b-lactone | Millipore Sigma | L7035 | Various other vendors |
| Cryogenic cup | Fisher | 033377B | Various other vendors |
| DMSO | DMSO | D8418 | Varous other vendors |
| DTT | Millipore Sigma | D0632 | Various other vendors |
| Glycerol | Millipore Sigma | G5516 | Various other vendors |
| H3 antibody | Abcam | ab1791 | Various other vendors |
| HEPES | Millipore Sigma | H3375 | Various other vendors |
| Hydrochloric acid | Fisher | SA48 | Various other vendors |
| IGEPAL (NP-40) | Millipore Sigma | I3021 | Various other vendors |
| K48 Ubiquitin Antibody | Abcam | ab140601 | Various other vendors |
| K63 Ubiquitin Antibody | Abcam | ab179434 | Various other vendors |
| KCl | Millipore Sigma | P9541 | Various other vendors |
| KONTES tissue grinder | VWR | KT885300-0002 | Various other vendors |
| Laemmli sample buffer | Bio-rad | 161-0737 | Various other vendors |
| Linear Ubiquitin Antibody | Life Sensors | AB-0130-0100 | Only M1 antibody |
| MgCl | Millipore Sigma | 442611 | Various other vendors |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 2231000213 | Various other manufacturers/models |
| myr-AIP | Enzo Life Sciences | BML-P212-0500 | Carried by Millipore-Sigma |
| NaCl | Millipore Sigma | S3014 | Various other vendors |
| Odyssey Fc Imaging System | LiCor | 2800-02 | Other vendors carry different versions |
| Phosphatase Inhibitor | Millipore Sigma | 524625 | Various other vendors |
| Precision Plus Protein Standard | Bio-rad | 161-0373 | Various other vendors |
| Protease Inhibitor | Millipore Sigma | P8340 | Various other vendors |
| PSD95 antibody | Cell signaling | 3450T | Various other vendors |
| SDS | Millipore Sigma | L3771 | Various other vendors |
| Sodium hydroxide | Fisher | SS255 | Various other vendors |
| Sucrose | Millipore Sigma | S0389 | Various other vendors |
| TBS | Alfa Aesar | J62938 | Varous other vendors |
| Tris | Millipore Sigma | T1503 | Various other vendors |
| Tween-20 | Fisher | BP337-100 | Various other vendors |
| Ubiquitin Antibody | Enzo Life Sciences | BML-PW8810 | Various other vendors |
References
- Hershko, A., Ciechanover, A. The ubiquitin system. Annu Rev Biochem. 67, 425-479 (1998).
- Akutsu, M., Dikic, I., Bremm, A. Ubiquitin chain diversity at a glance. Journal of Cell Science. 129 (5), 875-880 (2016).
- Ravid, T., Hochstrasser, M. Diversity of degradation signals in the ubiquitin-proteasome system. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (9), 679-690 (2008).
- Erpapazoglou, Z., Walker, O., Haguenauer-Tsapis, R. Versatile roles of k63-linked ubiquitin chains in trafficking. Cells. 3 (4), 1027-1088 (2014).
- Iwai, K., Fujita, H., Sasaki, Y. Linear ubiquitin chains: NF-kappaB signalling, cell death and beyond. Nature Review Molecular Cell Biology. 15 (8), 503-508 (2014).
- Rieser, E., Cordier, S. M., Walczak, H. Linear ubiquitination: a newly discovered regulator of cell signalling. Trends in Biochemical Sciences. 38 (2), 94-102 (2013).
- Collins, G. A., Goldberg, A. L. The Logic of the 26S Proteasome. Cell. 169 (5), 792-806 (2017).
- Bhat, K. P., et al. The 19S proteasome ATPase Sug1 plays a critical role in regulating MHC class II transcription. Molecular Immunology. 45 (8), 2214-2224 (2008).
- Ezhkova, E., Tansey, W. P. Proteasomal ATPases link ubiquitylation of histone H2B to methylation of histone H3. Molecular Cell. 13 (3), 435-442 (2004).
- Jarome, T. J., Helmstetter, F. J. The ubiquitin-proteasome system as a critical regulator of synaptic plasticity and long-term memory formation. Neurobiology of Learning and Memory. 105, 107-116 (2013).
- Hegde, A. N., Upadhya, S. C. The ubiquitin-proteasome pathway in health and disease of the nervous system. Trends in Neuroscience. 30 (11), 587-595 (2007).
- Adori, C., et al. Subcellular distribution of components of the ubiquitin-proteasome system in non-diseased human and rat brain. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 54 (2), 263-267 (2006).
- Upadhya, S. C., Ding, L., Smith, T. K., Hegde, A. N. Differential regulation of proteasome activity in the nucleus and the synaptic terminals. Neurochemistry International. 48 (4), 296-305 (2006).
- Enenkel, C., Lehmann, A., Kloetzel, P. M. Subcellular distribution of proteasomes implicates a major location of protein degradation in the nuclear envelope-ER network in yeast. EMBO Journal. 17 (21), 6144-6154 (1998).
- Jarome, T. J., Kwapis, J. L., Ruenzel, W. L., Helmstetter, F. J. CaMKII, but not protein kinase A, regulates Rpt6 phosphorylation and proteasome activity during the formation of long-term memories. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 7, 115 (2013).
- Jarome, T. J., Werner, C. T., Kwapis, J. L., Helmstetter, F. J. Activity dependent protein degradation is critical for the formation and stability of fear memory in the amygdala. PLoS One. 6 (9), e24349 (2011).
- Lopez-Salon, M., et al. The ubiquitin-proteasome cascade is required for mammalian long-term memory formation. European Journal of Neuroscience. 14 (11), 1820-1826 (2001).
- Reis, D. S., Jarome, T. J., Helmstetter, F. J. Memory formation for trace fear conditioning requires ubiquitin-proteasome mediated protein degradation in the prefrontal cortex. Frontiers in Behavior Neuroscience. 7, 150 (2013).
- Rosenberg, T., Elkobi, A., Rosenblum, K. mAChR-dependent decrease in proteasome activity in the gustatory cortex is necessary for novel taste learning. Neurobiology of Learning and Memory. 135, 115-124 (2016).
- Rosenberg, T., Elkobi, A., Dieterich, D. C., Rosenblum, K. NMDAR-dependent proteasome activity in the gustatory cortex is necessary for conditioned taste aversion. Neurobiology of Learning and Memory. 130, 7-16 (2016).
- Orsi, S. A., et al. Distinct subcellular changes in proteasome activity and linkage-specific protein polyubiquitination in the amygdala during the consolidation and reconsolidation of a fear memory. Neurobiology of Learning and Memory. 157, 1-11 (2019).
- Cullen, P. K., Ferrara, N. C., Pullins, S. E., Helmstetter, F. J. Context memory formation requires activity-dependent protein degradation in the hippocampus. Learning and Memory. 24 (11), 589-596 (2017).
- Jarome, T. J., Ferrara, N. C., Kwapis, J. L., Helmstetter, F. J. CaMKII regulates proteasome phosphorylation and activity and promotes memory destabilization following retrieval. Neurobiology of Learning and Memory. 128, 103-109 (2016).
- Lee, S. H., et al. Synaptic protein degradation underlies destabilization of retrieved fear memory. Science. 319 (5867), 1253-1256 (2008).
- Dunah, A. W., Standaert, D. G. Dopamine D1 receptor-dependent trafficking of striatal NMDA glutamate receptors to the postsynaptic membrane. Journal of Neuroscience. 21 (15), 5546-5558 (2001).
- Kelly, P. T., Cotman, C. W. Synaptic proteins. Characterization of tubulin and actin and identification of a distinct postsynaptic density polypeptide. Journal of Cell Biology. 79 (1), 173-183 (1978).
- Mengual, E., Arizti, P., Rodrigo, J., Gimenez-Amaya, J. M., Castano, J. G. Immunohistochemical distribution and electron microscopic subcellular localization of the proteasome in the rat CNS. Journal of Neuroscience. 16 (20), 6331-6341 (1996).
