Quantificando a ubiquitina subcelular-atividade de proteasome no cérebro de roedores
Summary
Este protocolo é projetado para quantificar eficientemente a atividade do sistema de ubiquitina-proteasome (UPS) em diferentes compartimentos celulares do cérebro de roedores. Os usuários podem examinar o funcionamento da UPS em frações nucleares, citoplasmáticas e sinápticas no mesmo animal, reduzindo a quantidade de tempo e o número de animais necessários para realizar essas análises complexas.
Abstract
O sistema do ubiquitin-proteasome é um regulador chave da degradação da proteína e de uma variedade de outros processos celulares nos eukaryotes. No cérebro, aumentos na atividade de ubiquitina-proteasome são críticos para a formação de plasticidade sináptica e memória e alterações aberrantes neste sistema estão associados a uma variedade de distúrbios neurológicos, neurodegenerativos e psiquiátricos. Um dos problemas no estudo do funcionamento do ubiquitina-proteasome no cérebro é que ele está presente em todos os compartimentos celulares, nos quais as metas proteicas, o papel funcional e os mecanismos de regulação podem variar muito. Como resultado, a capacidade de comparar diretamente a segmentação de proteínas de ubiquitina cerebral e a atividade catalítica de Proteassoma em diferentes compartimentos subcelulares dentro do mesmo animal é fundamental para compreender plenamente como a UPS contribui para a plasticidade sináptica, memória e doença. O método descrito aqui permite a coleta de frações sinápticas nucleares, citoplasmáticas e brutas do mesmo cérebro de roedores (Rat), seguidas pela quantificação simultânea da atividade catalítica do Proteassoma (indiretamente, proporcionando atividade do núcleo Proteassoma apenas) e marcação de proteínas de ubiquitina específica de ligação. Assim, o método pode ser usado para comparar diretamente as mudanças subcelulares na atividade do ubiquitin-proteasome em regiões diferentes do cérebro no mesmo animal durante a plasticidade sináptica, a formação da memória e Estados diferentes da doença. Este método também pode ser utilizado para avaliar a distribuição subcelular e a função de outras proteínas dentro do mesmo animal.
Introduction
O sistema de ubiquitina-proteasome (UPS) é uma complexa rede de estruturas proteicas interconectadas e ligases que controla a degradação da maioria das proteínas de vida curta nas células1. Neste sistema, as proteínas são marcadas para a degradação ou outros processos/destinos celulares pelo pequeno modificador ubiquitina. Uma proteína alvo pode adquirir 1-7 modificações de ubiquitina, que podem se unir em um dos sete sítios de lisina (K) (K6, K11, K27, K29, K33, K48 e K63) ou o N-terminal metionina (M1; conhecido como linear) na ubiquitina anterior2. Algumas dessas tags de poliubiquitina são específicas da degradação (K48)3, enquanto outras são em grande parte independentes do processo de degradação da proteína (M1)4,5,6. Assim, o processo de ubiquitinação de proteínas é incrivelmente complexo e a capacidade de quantificar as alterações em uma tag de poliubiquitina específica é fundamental para finalmente entender o papel dessa modificação dada no funcionamento celular. Complicando ainda mais o estudo deste sistema, o proteasome, que é a estrutura catalítica do UPS7, ambos degrada proteínas, mas também pode estar envolvido em outros processos não proteolíticos8,9. Não surprisingly então, desde que sua descoberta inicial, atividade normal e aberrante do ubiquitin-proteasome foi implicada na formação a longo prazo da memória e em uma variedade de Estados da doença, incluindo muitos neurológicos, neurodegenerativas e psiquiátricas distúrbios10,11. Como resultado, os métodos que podem efetivamente e eficientemente quantificar a atividade da UPS no cérebro são essenciais para finalmente compreender como este sistema é desregulado nos Estados de doença e o eventual desenvolvimento de opções de tratamento visando ubiquitina e/ou funcionamento do Proteassoma.
Há um número de edições em quantificar a atividade do ubiquitin-proteasome no tecido de cérebro dos ratos e dos ratos, que são os sistemas modelo os mais comuns usados para estudar a função do UPS, incluindo 1) a diversidade de modificações do ubiquitin, e 2) distribuição e regulação diferencial da UPS funcionando em compartimentos subcelulares12,13,14. Por exemplo, muitas das primeiras manifestações da função de ubiquitina-Proteassoma no cérebro durante a formação da memória usaram lisados de células inteiras e indicaram aumentos dependentes do tempo em ambas as proteínas ubiquitinação e Proteassoma atividade15, 16 anos de , 17 anos de , 18 anos de , 19 anos de , 20. no entanto, descobrimos recentemente que a atividade ubiquitina-proteasome variou amplamente entre os compartimentos subcelulares em resposta à aprendizagem, com aumentos simultâneos em algumas regiões e diminui em outros, um padrão que difere significativamente do que foi relatado previamente em lysates inteiros da pilha21. Isso é consistente com a limitação de uma abordagem de célula inteira, pois não pode dissociar a contribuição de mudanças na atividade da UPS em diferentes compartimentos subcelulares. Embora estudos mais recentes tenham empregado protocolos de fração sináptica para estudar a UPS especificamente em sinapses em resposta à aprendizagem22,23,24, os métodos utilizados oclusam a capacidade de medir alterações de ubiquitina-proteasome nucleares e citoplasmáticas no mesmo animal. Isso resulta em uma necessidade desnecessária de repetir experimentos várias vezes, coletando uma fração subcelular diferente em cada um. Não só isso resulta em uma maior perda de vida animal, mas elimina a capacidade de comparar diretamente a atividade da UPS em diferentes compartimentos subcelulares em resposta a um determinado evento ou durante um estado de doença específica. Considerando que os alvos proteicos da ubiquitina e do Proteassoma variam amplamente em toda a célula, compreender como a sinalização de ubiquitina-Proteassoma difere em compartimentos subcelulares distintos é fundamental para identificar o papel funcional da UPS na cérebro durante a formação da memória e desordens neurológicas, neurodegenerativas e psiquiátricas.
Para abordar esta necessidade, nós desenvolvemos recentemente um procedimento em que as frações nucleares, cytoplasmic e sináptica poderiam ser coletadas para uma determinada região do cérebro do mesmo animal21. Adicionalmente, para dar conta da quantidade limitada de proteínas que podem ser obtidas a partir da coleta de múltiplas frações subcelulares da mesma amostra, otimizamos protocolos previamente estabelecidos para o ensaio de atividade Proteassoma in vitro e ligação específica ubiquitinação da proteína em pilhas lysed coletadas do tecido de cérebro do roedor. Utilizando este protocolo, pudemos coletar e comparar diretamente as mudanças dependentes da aprendizagem na atividade Proteassoma, K48, K63, M1 e níveis globais de poliubiquitinação protéica no núcleo e citoplasma e nas sinapses na amígdala lateral de ratos. Aqui, descrevemos detalhadamente nosso procedimento (Figura 1), o que pode melhorar significativamente nossa compreensão de como a UPS está envolvida na formação de memória de longo prazo e em vários Estados de doenças. Entretanto, deve-se notar que a atividade de Proteassoma in vitro discutida em nosso protocolo, embora amplamente utilizada, não mede diretamente a atividade de complexos completos de Proteassoma 26S. Em vez disso, este ensaio mede a atividade do núcleo 20s, o que significa que só pode servir como um proxy para entender a atividade do núcleo em si, em oposição ao complexo de todo o Proteassoma 26S.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui, Nós demonstramos um método eficiente para quantificar mudanças na atividade do ubiquitin-proteasome através dos compartimentos subcellular diferentes no mesmo animal. Atualmente, a maioria das tentativas de medir as alterações subcelulares na atividade do sistema ubiquitina-proteasome tem se limitado a um único compartimento por amostra, resultando na necessidade de repetição de experimentos. Isso leva a custos significativos e perda de vida animal. Nosso protocolo alivia esse problema dividindo os hemisf?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por fundos de arranque da faculdade de ciências agrícolas e da vida e do colégio de Ciências da Virginia Tech. o TM é apoiado pelo programa George Washington Carver na Virginia Tech.
Materials
| 0.5M EDTA | Fisher | 15575020 | Various other vendors |
| 20S Proteasome Activity Kit | Millipore Sigma | APT280 | Other vendors carry different versions |
| ATP | Fisher | FERR1441 | Various other vendors |
| Beta-actin antibody | Cell signaling | 4967S | Various other vendors |
| Beta-tubulin antibody | Cell signaling | 2128T | Various other vendors |
| BioTek Synergy H1 plate reader | BioTek | VATECHH1MT3 | Other vendors carry different versions |
| B-mercaptoethanol | Fisher | ICN19024280 | Various other vendors |
| clasto lactacystin b-lactone | Millipore Sigma | L7035 | Various other vendors |
| Cryogenic cup | Fisher | 033377B | Various other vendors |
| DMSO | DMSO | D8418 | Varous other vendors |
| DTT | Millipore Sigma | D0632 | Various other vendors |
| Glycerol | Millipore Sigma | G5516 | Various other vendors |
| H3 antibody | Abcam | ab1791 | Various other vendors |
| HEPES | Millipore Sigma | H3375 | Various other vendors |
| Hydrochloric acid | Fisher | SA48 | Various other vendors |
| IGEPAL (NP-40) | Millipore Sigma | I3021 | Various other vendors |
| K48 Ubiquitin Antibody | Abcam | ab140601 | Various other vendors |
| K63 Ubiquitin Antibody | Abcam | ab179434 | Various other vendors |
| KCl | Millipore Sigma | P9541 | Various other vendors |
| KONTES tissue grinder | VWR | KT885300-0002 | Various other vendors |
| Laemmli sample buffer | Bio-rad | 161-0737 | Various other vendors |
| Linear Ubiquitin Antibody | Life Sensors | AB-0130-0100 | Only M1 antibody |
| MgCl | Millipore Sigma | 442611 | Various other vendors |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 2231000213 | Various other manufacturers/models |
| myr-AIP | Enzo Life Sciences | BML-P212-0500 | Carried by Millipore-Sigma |
| NaCl | Millipore Sigma | S3014 | Various other vendors |
| Odyssey Fc Imaging System | LiCor | 2800-02 | Other vendors carry different versions |
| Phosphatase Inhibitor | Millipore Sigma | 524625 | Various other vendors |
| Precision Plus Protein Standard | Bio-rad | 161-0373 | Various other vendors |
| Protease Inhibitor | Millipore Sigma | P8340 | Various other vendors |
| PSD95 antibody | Cell signaling | 3450T | Various other vendors |
| SDS | Millipore Sigma | L3771 | Various other vendors |
| Sodium hydroxide | Fisher | SS255 | Various other vendors |
| Sucrose | Millipore Sigma | S0389 | Various other vendors |
| TBS | Alfa Aesar | J62938 | Varous other vendors |
| Tris | Millipore Sigma | T1503 | Various other vendors |
| Tween-20 | Fisher | BP337-100 | Various other vendors |
| Ubiquitin Antibody | Enzo Life Sciences | BML-PW8810 | Various other vendors |
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