Cuantificación de la actividad ubiquitina-proteosoma subcelular en el cerebro de los roedores
Summary
Este protocolo está diseñado para cuantificar eficientemente la actividad del sistema de ubiquitina-proteasoma (UPS) en diferentes compartimentos celulares del cerebro de roedores. Los usuarios pueden examinar el funcionamiento de UPS en fracciones nucleares, citoplasmáticas y sinápticas en el mismo animal, reduciendo la cantidad de tiempo y número de animales necesarios para realizar estos análisis complejos.
Abstract
El sistema de ubiquitina-proteasoma es un regulador clave de la degradación de proteínas y una variedad de otros procesos celulares en eucariotas. En el cerebro, los aumentos en la actividad ubiquitina-proteasoma son críticos para la plasticidad sináptica y la formación de la memoria y los cambios aberrantes en este sistema se asocian con una variedad de trastornos neurológicos, neurodegenerativos y psiquiátricos. Uno de los problemas en el estudio de la ubiquitina-proteosoma funcionamiento en el cerebro es que está presente en todos los compartimentos celulares, en el que las dianas de la proteína, el papel funcional y los mecanismos de regulación pueden variar ampliamente. Como resultado, la capacidad de comparar directamente la orientación a la proteína ubiquitina cerebral y la actividad catalítica proteasoma en diferentes compartimentos subcelulares dentro del mismo animal es fundamental para comprender completamente cómo el SAI contribuye a la plasticidad sináptica, memoria y enfermedades. El método descrito aquí permite la recolección de fracciones sinápticas nucleares, citoflásmáticas y brutas del mismo cerebro de roedor (rata), seguida de la cuantificación simultánea de la actividad catalítica proteasome (indirectamente, proporcionando actividad del núcleo de proteasoma únicamente) y el etiquetado de proteína de ubiquitina específica para varillajes. Por lo tanto, el método se puede utilizar para comparar directamente los cambios subcelulares en la actividad ubiquitina-proteosoma en diferentes regiones cerebrales en el mismo animal durante la plasticidad sináptica, la formación de la memoria y diferentes estados de enfermedad. Este método también se puede utilizar para evaluar la distribución subcelular y la función de otras proteínas dentro del mismo animal.
Introduction
El sistema de ubiquitina-proteasoma (UPS) es una compleja red de estructuras y ligasas de proteínas interconectadas que controla la degradación de la mayoría de las proteínas de corta duración en las células1. En este sistema, las proteínas se marcan para la degradación u otros procesos/fates celulares por el pequeño modificador ubiquitina. Una proteína diana puede adquirir 1-7 modificaciones de ubiquitina, que pueden unirse en uno de los siete sitios de lisina (K) (K6, K11, K27, K29, K33, K48y K63) o la N-terminal metionina (M1; como se conoce como lineal) en la ubiquitina 2 anterior. Algunas de estas etiquetas de poliubiquitina son específicas de la degradación (K48)3, mientras que otras son en gran parte independientes del proceso de degradación de proteínas (M1)4,5,6. Por lo tanto, el proceso de ubiquitinación de proteínas es increíblemente complejo y la capacidad de cuantificar los cambios en una etiqueta de poliubiquitina específica es fundamental para entender en última instancia el papel de esa modificación dada en el funcionamiento celular. Complicando aún más el estudio de este sistema, el proteosoma,que es la estructura catalítica del SAI 7, ambos degradan las proteínas pero también pueden participar en otros procesos no proteolíticos8,9. No es de extrañar entonces, desde su descubrimiento inicial, la actividad ubiquitina-proteasoma normal y aberrante se ha implicado en la formación de la memoria a largo plazo y una variedad de estados de la enfermedad, incluyendo muchos neurológicos, neurodegenerativos y psiquiátricos trastornos10,11. Como resultado, los métodos que pueden cuantificar de manera efectiva y eficiente la actividad del SAI en el cerebro son fundamentales para entender en última instancia cómo se desreglamenta este sistema en los estados de la enfermedad y el desarrollo final de opciones de tratamiento dirigidas a la ubiquitina y/o proteosoma.
Hay una serie de problemas en la cuantificación de la actividad ubiquitina-proteasoma en el tejido cerebral de ratas y ratones, que son los sistemas modelo más comunes utilizados para estudiar la función del SAI, incluyendo 1) la diversidad de modificaciones de ubiquitina, y 2) la distribución y 2) la distribución y 2) la distribución y 2) la distribución y 2) la distribución y 2) la distribución y 2) la distribución y 2) la distribución y 2) y regulación diferencial del funcionamiento del SAI en los compartimentos subcelulares12,13,14. Por ejemplo, muchas de las primeras demostraciones de la función ubiquitina-proteasoma en el cerebro durante la formación de la memoria utilizaron lisatos de células enteras e indicaron aumentos dependientes del tiempo tanto en la ubiquitinación de proteínas como en la actividad de proteasoma15, 16 , 17 , 18 , 19 , 20. Sin embargo, recientemente encontramos que la actividad ubiquitina-proteasoma varió ampliamente entre los compartimentos subcelulares en respuesta al aprendizaje, con aumentos simultáneos en algunas regiones y disminuciones en otras, un patrón que difiere significativamente de lo que se informó anteriormente en las lisades de células enteras21. Esto es consistente con la limitación de un enfoque de células enteras, ya que no puede disociar la contribución de los cambios en la actividad de UPS en diferentes compartimentos subcelulares. Aunque estudios más recientes han empleado protocolos de fracción sináptica para estudiar el SAI específicamente en sinapsis en respuesta al aprendizaje22,23,24, los métodos utilizados ocluy la capacidad de medir nuclear y citoplasma ubiquitina-proteosoma cambios en el mismo animal. Esto resulta en una necesidad innecesaria de repetir experimentos varias veces, recopilando una fracción subcelular diferente en cada uno. Esto no sólo resulta en una mayor pérdida de vidas de animales, sino que elimina la capacidad de comparar directamente la actividad de UPS en diferentes compartimentos subcelulares en respuesta a un evento dado o durante un estado específico de la enfermedad. Teniendo en cuenta que las dianas proteicas de la ubiquitina y el proteosoma varían ampliamente a lo largo de la célula, entender cómo la señalización ubiquitina-proteosoma difiere en distintos compartimentos subcelulares es fundamental para identificar el papel funcional del SAI en el SAI cerebro durante la formación de la memoria y trastornos neurológicos, neurodegenerativos y psiquiátricos.
Para hacer frente a esta necesidad, hemos desarrollado recientemente un procedimiento en el que se podrían recolectar fracciones nucleares, citoplasmáticas y sinápticas para una región cerebral determinada del mismo animal21. Además, para tener en cuenta la cantidad limitada de proteína que se puede obtener de la recolección de múltiples fracciones subcelulares de la misma muestra, optimizamos protocolos previamente establecidos para analizar la actividad de proteasoma in vitro y la actividad específica de la vinculación ubiquitinación de proteínas en células lysed recogidas del tejido cerebral de roedores. Usando este protocolo, pudimos recopilar y comparar directamente los cambios dependientes del aprendizaje en la actividad del proteasoma, K48, K63, M1 y los niveles generales de poliubiquitinación de proteínas en el núcleo y el citoplasma y en las sinapsis en la amígdala lateral de ratas. Aquí, describimos en detalle nuestro procedimiento (Figura1), que podría mejorar significativamente nuestra comprensión de cómo el SAI está involucrado en la formación de la memoria a largo plazo y varios estados de la enfermedad. Sin embargo, cabe señalar que la actividad de proteasoma in vitro discutida en nuestro protocolo, aunque ampliamente utilizado, no mide directamente la actividad de los complejos completos de proteasoma 26S. Más bien, este ensayo mide la actividad del núcleo 20S, lo que significa que sólo puede servir como un apoderado para entender la actividad del núcleo en sí en lugar de todo el complejo de proteasoma 26S.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí, demostramos un método eficiente para cuantificar los cambios en la actividad ubiquitina-proteosoma en diferentes compartimentos subcelulares en el mismo animal. Actualmente, la mayoría de los intentos de medir los cambios subcelulares en la actividad del sistema de ubiquitina-proteosoma se han limitado a un solo compartimento por muestra, lo que resulta en la necesidad de repetir los experimentos. Esto conduce a costos significativos y pérdida de vida animal. Nuestro protocolo alivia este problema dividiendo he…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por fondos de startups de la Facultad de Ciencias Agrícolas y de la Vida y la Facultad de Ciencias de Virginia Tech. T.M. cuenta con el apoyo del Programa George Washington Carver en Virginia Tech.
Materials
| 0.5M EDTA | Fisher | 15575020 | Various other vendors |
| 20S Proteasome Activity Kit | Millipore Sigma | APT280 | Other vendors carry different versions |
| ATP | Fisher | FERR1441 | Various other vendors |
| Beta-actin antibody | Cell signaling | 4967S | Various other vendors |
| Beta-tubulin antibody | Cell signaling | 2128T | Various other vendors |
| BioTek Synergy H1 plate reader | BioTek | VATECHH1MT3 | Other vendors carry different versions |
| B-mercaptoethanol | Fisher | ICN19024280 | Various other vendors |
| clasto lactacystin b-lactone | Millipore Sigma | L7035 | Various other vendors |
| Cryogenic cup | Fisher | 033377B | Various other vendors |
| DMSO | DMSO | D8418 | Varous other vendors |
| DTT | Millipore Sigma | D0632 | Various other vendors |
| Glycerol | Millipore Sigma | G5516 | Various other vendors |
| H3 antibody | Abcam | ab1791 | Various other vendors |
| HEPES | Millipore Sigma | H3375 | Various other vendors |
| Hydrochloric acid | Fisher | SA48 | Various other vendors |
| IGEPAL (NP-40) | Millipore Sigma | I3021 | Various other vendors |
| K48 Ubiquitin Antibody | Abcam | ab140601 | Various other vendors |
| K63 Ubiquitin Antibody | Abcam | ab179434 | Various other vendors |
| KCl | Millipore Sigma | P9541 | Various other vendors |
| KONTES tissue grinder | VWR | KT885300-0002 | Various other vendors |
| Laemmli sample buffer | Bio-rad | 161-0737 | Various other vendors |
| Linear Ubiquitin Antibody | Life Sensors | AB-0130-0100 | Only M1 antibody |
| MgCl | Millipore Sigma | 442611 | Various other vendors |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 2231000213 | Various other manufacturers/models |
| myr-AIP | Enzo Life Sciences | BML-P212-0500 | Carried by Millipore-Sigma |
| NaCl | Millipore Sigma | S3014 | Various other vendors |
| Odyssey Fc Imaging System | LiCor | 2800-02 | Other vendors carry different versions |
| Phosphatase Inhibitor | Millipore Sigma | 524625 | Various other vendors |
| Precision Plus Protein Standard | Bio-rad | 161-0373 | Various other vendors |
| Protease Inhibitor | Millipore Sigma | P8340 | Various other vendors |
| PSD95 antibody | Cell signaling | 3450T | Various other vendors |
| SDS | Millipore Sigma | L3771 | Various other vendors |
| Sodium hydroxide | Fisher | SS255 | Various other vendors |
| Sucrose | Millipore Sigma | S0389 | Various other vendors |
| TBS | Alfa Aesar | J62938 | Varous other vendors |
| Tris | Millipore Sigma | T1503 | Various other vendors |
| Tween-20 | Fisher | BP337-100 | Various other vendors |
| Ubiquitin Antibody | Enzo Life Sciences | BML-PW8810 | Various other vendors |
References
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