Kvantifiera subcellulär ubiquitin-Proteasome-aktivitet i gnagare hjärnan
Summary
Detta protokoll är utformat för att effektivt kvantifiera ubiquitin-Proteasome system (UPS) aktivitet i olika cellulära fack i gnagare hjärnan. Användare kan undersöka UPS fungerar i nukleära, cytoplasmiska och synaptiska fraktioner i samma djur, minska mängden tid och antal djur som behövs för att utföra dessa komplexa analyser.
Abstract
Den ubiquitin-Proteasome systemet är en viktig regulator av proteinnedbrytning och en mängd andra cellulära processer i eukaryotes. I hjärnan, ökningar av ubiquitin-Proteasome aktivitet är kritiska för synaptisk plasticitet och minnesbildning och avvikande förändringar i detta system är förknippade med en mängd olika neurologiska, neurodegenerativa och psykiatriska störningar. En av de frågor som studerar ubiquitin-Proteasome funktion i hjärnan är att det är närvarande i alla cellulära fack, där protein mål, funktionell roll och mekanismer för reglering kan variera kraftigt. Som ett resultat, förmågan att direkt jämföra hjärnan ubiquitin protein inriktning och proteasom katalytisk aktivitet i olika subcellulära fack inom samma djur är avgörande för att fullt förstå hur UPS bidrar till synaptisk plasticitet, minne och sjukdom. Den metod som beskrivs här tillåter insamling av nukleära, cytoplasmiska och råa synaptiska fraktioner från samma gnagare (råtta) hjärna, följt av samtidig kvantifiering av proteasom katalytisk aktivitet (indirekt, som ger aktivitet av proteasom kärna endast) och länkningsspecifika ubiquitin protein märkning. Sålunda, metoden kan användas för att direkt jämföra subcellulära förändringar i ubiquitin-Proteasome aktivitet i olika hjärnregioner i samma djur under synaptisk plasticitet, minnesbildning och olika sjukdomstillstånd. Denna metod kan också användas för att bedöma den subcellulära distributionen och funktionen av andra proteiner inom samma djur.
Introduction
Ubiquitin-Proteasome-systemet (UPS) är ett komplext nätverk av sammankopplade proteinstrukturer och Ligaser som kontrollerar nedbrytningen av de flesta kortlivade proteiner i celler1. I detta system är proteiner märkta för nedbrytning eller andra cellulära processer/öden av den lilla modifieraren ubiquitin. Ett målprotein kan förvärva 1-7 ubiquitin modifieringar, som kan länka samman på en av sju lysin (K) platser (K6, K11, K27, K29, K33, K48 och K63) eller N-Terminal metionin (M1, så kallad linjär) i föregående ubiquitin2. Några av dessa polyubiquitin taggar är nedbrytnings-specifika (K48)3, medan andra är till stor del oberoende av proteinnedbrytning processen (M1)4,5,6. Sålunda, proteinet ubiquitination förlopp är oerhört komplex och förmågan till kvantifiera förändringen i en bestämd polyubiquitin tag är kritisk för i slutändan förstå den roll av så pass givit modifiera i Cellular funktion. Ytterligare komplierar studiet av detta system, Proteasome, som är den katalytiska strukturen av UPS7, både försämrar proteiner men kan också vara inblandade i andra icke-proteolytiska processer8,9. Inte överraskande då, sedan dess första upptäckten, normal och avvikande ubiquitin-Proteasome aktivitet har varit inblandad i långtids minnesbildning och en mängd olika sjukdomstillstånd, inklusive många neurologiska, neurodegenerativa och psykiatriska störningar10,11. Som ett resultat av detta är metoder som effektivt och effektivt kan kvantifiera UPS aktivitet i hjärnan avgörande för att i slutändan förstå hur detta system är dysreglerat i sjukdomstillstånd och eventuell utveckling av behandlingsalternativ riktade mot ubiquitin och/eller proteasom fungerar.
Det finns ett antal frågor att kvantifiera ubiquitin-Proteasome aktivitet i hjärnvävnad från råttor och möss, som är de vanligaste modellsystem som används för att studera UPS-funktion, inklusive 1) mångfalden av ubiquitin modifieringar, och 2) distribution och differentiell reglering av UPS fungerar över subcellulära fack12,13,14. Till exempel, många av de tidiga demonstrationerna av ubiquitin-proteasom funktion i hjärnan under minnesbildning används hela cellen celllysat och indikerade tidsberoende ökningar i både protein ubiquitination och proteasom aktivitet15, 16 , 17 , 18 , 19 , 20. Vi fann dock nyligen att ubiquitin-Proteasome aktivitet varierade kraftigt över subcellulära fack som svar på inlärning, med samtidiga ökningar i vissa regioner och minskningar i andra, ett mönster som skiljer sig avsevärt från vad som tidigare rapporterades i hela cellen celllysat21. Detta är förenligt med begränsningen av en hel cells strategi, eftersom den inte kan separera bidraget från förändringar i UPS-aktivitet i olika subcellulära fack. Även nyare studier har använt synaptiska fraktions protokoll för att studera UPS specifikt på synapser som svar på lärande22,23,24, de metoder som används ockludera förmågan att mäta nukleära och cytoplasmiska ubiquitin-Proteasome förändringar i samma djur. Detta resulterar i ett onödigt behov av att upprepa experiment flera gånger, samla in en annan subcellulär fraktion i varje. Detta resulterar inte bara i en större förlust av djurliv, men det eliminerar möjligheten att direkt jämföra UPS aktivitet mellan olika subcellulära fack som svar på en viss händelse eller under en viss sjukdomstillstånd. Med tanke på att protein målen för ubiquitin och proteasom varierar kraftigt i hela cellen, förstå hur ubiquitin-proteasom signalering skiljer sig i olika subcellulära fack är avgörande för att identifiera den funktionella roll UPS i hjärnan under minnesbildning och neurologiska, neurodegenerativa och psykiatriska störningar.
För att ta itu med detta behov utvecklade vi nyligen ett förfarande där nukleära, cytoplasmiska och synaptiska fraktioner kunde samlas in för en given hjärnregion från samma djur21. Dessutom, för att ta hänsyn till den begränsade mängden protein som kan erhållas från insamling av flera subcellulära fraktioner från samma prov, vi optimerat tidigare etablerade protokoll till assay in vitro proteasom aktivitet och länkspecifika protein ubiquitination i lyserade celler som samlats in från gnagare hjärnvävnad. Med hjälp av detta protokoll, kunde vi samla in och direkt jämföra lärande-beroende förändringar i proteasom aktivitet, K48, K63, M1 och övergripande protein polvubiquitinering nivåer i kärnan och cytoplasman och vid synapser i sidled amygdala av råttor. Här beskriver vi i detalj vårt förfarande (figur 1), som avsevärt skulle kunna förbättra vår förståelse för hur UPS är involverad i långtids minnesbildning och olika sjukdomstillstånd. Det bör dock noteras att in vitro proteasom verksamhet diskuteras i vårt protokoll, medan allmänt används, inte direkt mäta aktiviteten av kompletta 26S proteasom komplex. Snarare, denna analys mäter aktiviteten av 20-talet kärnan, vilket innebär att det bara kan fungera som en proxy för att förstå verksamheten i själva kärnan i motsats till hela 26S proteasom Complex.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här visar vi en effektiv metod för att kvantifiera förändringar i ubiquitin-Proteasome-aktivitet mellan olika subcellulära fack i samma djur. För närvarande, de flesta försök att mäta subcellulära förändringar i aktiviteten av ubiquitin-Proteasome systemet har begränsats till ett enda fack per prov, vilket resulterar i behovet av att upprepa experiment. Detta leder till betydande kostnader och förlust av djurlivet. Vårt protokoll lindrar detta problem genom att dela upp halvklot, vilket gör att olika cel…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av startup medel från College of Agricultural och Life Sciences och College of Science vid Virginia Tech. T.M. stöds av George Washington Carver program på Virginia Tech.
Materials
| 0.5M EDTA | Fisher | 15575020 | Various other vendors |
| 20S Proteasome Activity Kit | Millipore Sigma | APT280 | Other vendors carry different versions |
| ATP | Fisher | FERR1441 | Various other vendors |
| Beta-actin antibody | Cell signaling | 4967S | Various other vendors |
| Beta-tubulin antibody | Cell signaling | 2128T | Various other vendors |
| BioTek Synergy H1 plate reader | BioTek | VATECHH1MT3 | Other vendors carry different versions |
| B-mercaptoethanol | Fisher | ICN19024280 | Various other vendors |
| clasto lactacystin b-lactone | Millipore Sigma | L7035 | Various other vendors |
| Cryogenic cup | Fisher | 033377B | Various other vendors |
| DMSO | DMSO | D8418 | Varous other vendors |
| DTT | Millipore Sigma | D0632 | Various other vendors |
| Glycerol | Millipore Sigma | G5516 | Various other vendors |
| H3 antibody | Abcam | ab1791 | Various other vendors |
| HEPES | Millipore Sigma | H3375 | Various other vendors |
| Hydrochloric acid | Fisher | SA48 | Various other vendors |
| IGEPAL (NP-40) | Millipore Sigma | I3021 | Various other vendors |
| K48 Ubiquitin Antibody | Abcam | ab140601 | Various other vendors |
| K63 Ubiquitin Antibody | Abcam | ab179434 | Various other vendors |
| KCl | Millipore Sigma | P9541 | Various other vendors |
| KONTES tissue grinder | VWR | KT885300-0002 | Various other vendors |
| Laemmli sample buffer | Bio-rad | 161-0737 | Various other vendors |
| Linear Ubiquitin Antibody | Life Sensors | AB-0130-0100 | Only M1 antibody |
| MgCl | Millipore Sigma | 442611 | Various other vendors |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 2231000213 | Various other manufacturers/models |
| myr-AIP | Enzo Life Sciences | BML-P212-0500 | Carried by Millipore-Sigma |
| NaCl | Millipore Sigma | S3014 | Various other vendors |
| Odyssey Fc Imaging System | LiCor | 2800-02 | Other vendors carry different versions |
| Phosphatase Inhibitor | Millipore Sigma | 524625 | Various other vendors |
| Precision Plus Protein Standard | Bio-rad | 161-0373 | Various other vendors |
| Protease Inhibitor | Millipore Sigma | P8340 | Various other vendors |
| PSD95 antibody | Cell signaling | 3450T | Various other vendors |
| SDS | Millipore Sigma | L3771 | Various other vendors |
| Sodium hydroxide | Fisher | SS255 | Various other vendors |
| Sucrose | Millipore Sigma | S0389 | Various other vendors |
| TBS | Alfa Aesar | J62938 | Varous other vendors |
| Tris | Millipore Sigma | T1503 | Various other vendors |
| Tween-20 | Fisher | BP337-100 | Various other vendors |
| Ubiquitin Antibody | Enzo Life Sciences | BML-PW8810 | Various other vendors |
References
- Hershko, A., Ciechanover, A. The ubiquitin system. Annu Rev Biochem. 67, 425-479 (1998).
- Akutsu, M., Dikic, I., Bremm, A. Ubiquitin chain diversity at a glance. Journal of Cell Science. 129 (5), 875-880 (2016).
- Ravid, T., Hochstrasser, M. Diversity of degradation signals in the ubiquitin-proteasome system. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (9), 679-690 (2008).
- Erpapazoglou, Z., Walker, O., Haguenauer-Tsapis, R. Versatile roles of k63-linked ubiquitin chains in trafficking. Cells. 3 (4), 1027-1088 (2014).
- Iwai, K., Fujita, H., Sasaki, Y. Linear ubiquitin chains: NF-kappaB signalling, cell death and beyond. Nature Review Molecular Cell Biology. 15 (8), 503-508 (2014).
- Rieser, E., Cordier, S. M., Walczak, H. Linear ubiquitination: a newly discovered regulator of cell signalling. Trends in Biochemical Sciences. 38 (2), 94-102 (2013).
- Collins, G. A., Goldberg, A. L. The Logic of the 26S Proteasome. Cell. 169 (5), 792-806 (2017).
- Bhat, K. P., et al. The 19S proteasome ATPase Sug1 plays a critical role in regulating MHC class II transcription. Molecular Immunology. 45 (8), 2214-2224 (2008).
- Ezhkova, E., Tansey, W. P. Proteasomal ATPases link ubiquitylation of histone H2B to methylation of histone H3. Molecular Cell. 13 (3), 435-442 (2004).
- Jarome, T. J., Helmstetter, F. J. The ubiquitin-proteasome system as a critical regulator of synaptic plasticity and long-term memory formation. Neurobiology of Learning and Memory. 105, 107-116 (2013).
- Hegde, A. N., Upadhya, S. C. The ubiquitin-proteasome pathway in health and disease of the nervous system. Trends in Neuroscience. 30 (11), 587-595 (2007).
- Adori, C., et al. Subcellular distribution of components of the ubiquitin-proteasome system in non-diseased human and rat brain. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 54 (2), 263-267 (2006).
- Upadhya, S. C., Ding, L., Smith, T. K., Hegde, A. N. Differential regulation of proteasome activity in the nucleus and the synaptic terminals. Neurochemistry International. 48 (4), 296-305 (2006).
- Enenkel, C., Lehmann, A., Kloetzel, P. M. Subcellular distribution of proteasomes implicates a major location of protein degradation in the nuclear envelope-ER network in yeast. EMBO Journal. 17 (21), 6144-6154 (1998).
- Jarome, T. J., Kwapis, J. L., Ruenzel, W. L., Helmstetter, F. J. CaMKII, but not protein kinase A, regulates Rpt6 phosphorylation and proteasome activity during the formation of long-term memories. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 7, 115 (2013).
- Jarome, T. J., Werner, C. T., Kwapis, J. L., Helmstetter, F. J. Activity dependent protein degradation is critical for the formation and stability of fear memory in the amygdala. PLoS One. 6 (9), e24349 (2011).
- Lopez-Salon, M., et al. The ubiquitin-proteasome cascade is required for mammalian long-term memory formation. European Journal of Neuroscience. 14 (11), 1820-1826 (2001).
- Reis, D. S., Jarome, T. J., Helmstetter, F. J. Memory formation for trace fear conditioning requires ubiquitin-proteasome mediated protein degradation in the prefrontal cortex. Frontiers in Behavior Neuroscience. 7, 150 (2013).
- Rosenberg, T., Elkobi, A., Rosenblum, K. mAChR-dependent decrease in proteasome activity in the gustatory cortex is necessary for novel taste learning. Neurobiology of Learning and Memory. 135, 115-124 (2016).
- Rosenberg, T., Elkobi, A., Dieterich, D. C., Rosenblum, K. NMDAR-dependent proteasome activity in the gustatory cortex is necessary for conditioned taste aversion. Neurobiology of Learning and Memory. 130, 7-16 (2016).
- Orsi, S. A., et al. Distinct subcellular changes in proteasome activity and linkage-specific protein polyubiquitination in the amygdala during the consolidation and reconsolidation of a fear memory. Neurobiology of Learning and Memory. 157, 1-11 (2019).
- Cullen, P. K., Ferrara, N. C., Pullins, S. E., Helmstetter, F. J. Context memory formation requires activity-dependent protein degradation in the hippocampus. Learning and Memory. 24 (11), 589-596 (2017).
- Jarome, T. J., Ferrara, N. C., Kwapis, J. L., Helmstetter, F. J. CaMKII regulates proteasome phosphorylation and activity and promotes memory destabilization following retrieval. Neurobiology of Learning and Memory. 128, 103-109 (2016).
- Lee, S. H., et al. Synaptic protein degradation underlies destabilization of retrieved fear memory. Science. 319 (5867), 1253-1256 (2008).
- Dunah, A. W., Standaert, D. G. Dopamine D1 receptor-dependent trafficking of striatal NMDA glutamate receptors to the postsynaptic membrane. Journal of Neuroscience. 21 (15), 5546-5558 (2001).
- Kelly, P. T., Cotman, C. W. Synaptic proteins. Characterization of tubulin and actin and identification of a distinct postsynaptic density polypeptide. Journal of Cell Biology. 79 (1), 173-183 (1978).
- Mengual, E., Arizti, P., Rodrigo, J., Gimenez-Amaya, J. M., Castano, J. G. Immunohistochemical distribution and electron microscopic subcellular localization of the proteasome in the rat CNS. Journal of Neuroscience. 16 (20), 6331-6341 (1996).
