Fysiologisk patient afledte 3D Sfæroider til anti-neoplastisk Drug screening for at målrette kræft stamceller

Summary

Denne protokol beskriver generering af patient afledte sfæroider og downstream-analyse, herunder kvantificering af proliferation, cytotoksicitets test, flow cytometri, immunofluorescens farvning og konfokale billeder, med henblik på at vurdere Kandidaternes potentiale som anti-neoplastisk terapi. Denne protokol understøtter præcisionsmedicin med identifikation af specifikke lægemidler for hver patient og sygdomsstadie.

Abstract

I denne protokol skitserer vi proceduren for generering af tumor sfæroider inden for 384-godt hængende dråber for at give mulighed for høj gennemløb screening af anti-cancer Therapeutics i en fysiologisk repræsentative mikromiljø. Vi skitserer dannelsen af patient afledte kræft stamceller sfæroider, samt, manipulation af disse sfæroider til grundig analyse efter narkotikabehandling. Specifikt, vi beskriver indsamling af sfæide morfologi, proliferation, levedygtighed, lægemiddeltoksicitet, celle fænotype og celle lokaliseringsdata. Denne protokol fokuserer stærkt på analyseteknikker, der let implementeres ved hjælp af 384-godt hængende drop platform, hvilket gør den ideel til høj gennemstrømning Drug screening. Mens vi understrege betydningen af denne model i ovariecancer undersøgelser og kræft stamcelleforskning, den 384-Well platform er modtagelig for forskning af andre kræfttyper og sygdomsmodeller, udvide nytten af platformen til mange områder. Ved at forbedre hastigheden af personlig Drug screening og kvaliteten af screening resultater gennem let implementeret fysiologisk repræsentative 3D-kulturer, denne platform er forudsagt til at støtte i udviklingen af nye lægemidler og patient-specifikke behandlingsstrategier og har dermed vidtrækkende klinisk virkning.

Introduction

Verdensomspændende kræft relateret dødelighed nåede en vejafgift på 9.800.000 dødsfald i 2018¹, hvilket understreger behovet for udvikling af forbedrede terapeutiske. Desværre, omkostningerne ved at udvikle kræftmedicin er stigende, med udviklingen af et enkelt stof koster ca 650.000.000 USD² angiver behovet for forbedrede strategier til at udvikle nye anti-cancer narkotika. Kræft stamceller (CSCs), som er karakteriseret ved øget chemoresistance³, evnen til at selv forny, og evnen til at frø nye tumorer⁴ menes at være ansvarlig for tumor recidiv⁴, metastase⁵, og chemoresistance^4,6, som alle bidrager til den maligne kapacitet af tumoren og dermed den høje dødstal. I kræft i æggestokkene, disse celler er fundet beriget i den maligne ascites væske i bughulen, en tilstand forbundet med dårlige kliniske resultater¹. Som et resultat af de ondartede kapaciteter af CSCs, har der været et skub til at udvikle nye CSC målretning narkotika til brug i forbindelse med traditionelle kemoterapeutika. Der er flere udfordringer, der ledsager udviklingen af CSC målretning narkotika herunder: 1) vanskeligheder med at udvide og vedligeholde CSCs in vitro; 2) mangel på patientprøver; 3) den fysiologiske relevans af kultur platformen; og 4) heterogenitet i lægemiddel følsomhed mellem patienter. Denne protokol skitserer gennemførelsen af en høj gennemløb 3D kultur platform, der kan overvinde hver af disse udfordringer. Dette system giver især mulighed for hurtig lægemiddel screening ved hjælp af et lille antal patient afledte ovarie-CSCs og er meget modtagelig for downstream-analyseteknikker. Mens ideel til at studere kræft i æggestokkene og CSCs, vores platform er også værdifuldt i at studere andre kræftformer og differentierede celletyper i komplekse 3D-miljøer.

Komplekse 3-dimensionelle (3D) modeller er afgørende for at studere tumor mikromiljø (TME), som er en 3D niche består af kræftceller, ikke-kræft støtte celler, og ekstracellulære matrix (ECM) proteiner⁴. Dette 3D-miljø resulterer i unikke celle morfologi, celle celle-og cellematrix interaktioner, Celledifferentiering, celle migration, celletæthed og diffusions gradienter sammenlignet med traditionel 2D-cellekultur in vitro⁴. Alle disse faktorer kulminerede i differentiallægemiddel respons inden for 3D-kulturer, udviser øget resistens over for lægemidler og fysiologisk relevans^7,8. På grund af den rolle 3D TME i CSC differentiering og chemoresistance, er det vigtigt at screene for CSC målretning narkotika i fysiologisk mikromiljøer. Forbedring af den fysiologiske relevans af CSC Drug screening platforme har potentiale til at forbedre patientspecifikke Drug screening, narkotika udvikling, formulering af behandlingsstrategier, og i sidste ende kliniske resultater. Det er lige så vigtigt, at platformen anvendes til Drug screening være høj gennemløb og kompatibel med downstream analysemetoder til at minimere omkostninger, tid og klinisk oversættelse tid af lovende narkotika⁹.

I øjeblikket, den komplekse TME er bedst vedligeholdt for Drug screening applikationer gennem in vivo modeller såsom murine og tumormodeller, celle line-afledte xenografts, og patient-afledte xenograft (PDX) modeller¹², da de giver fysiologisk Betingelser. Men den lave-gennemløb karakter af disse modeller, samt, de omkostninger, tid, og tekniske færdigheder, som de kræver begrænser deres nytte i hurtige, høj gennemløb Drug screening applikationer¹³. Som alternativer til disse in vivo modeller, mange in vitro 3D-modeller udnytter silicagelrogeler⁸, kultur inden for mikrofluidisk enheder eller ‘ orgel-on-a-chip ‘ enheder^10,14, og ikke-tilhængere kulturer^3,8 er også blevet udviklet på grund af deres lave adgangsbarriere i form af omkostninger, tid og krævede skillset.

Hydrogel kultur platforme er fordelagtige i den fine kontrol, der ydes over matrix sammensætning, mekaniske egenskaber, og matrixstruktur¹⁵; Men, de kan hæmme høj densitet cellekultur¹⁴. Desuden, høst celler fra silicagelrogeler kan komplicere downstream analyse, på grund af potentielt skadelige virkninger af høstmetoder¹⁵. Microfluidic-enheder er på den anden side mikroskala anordninger, der giver mulighed for output detektering inden for samme enhed og for cellekultur på fysiologisk relevante skalaer med minimal indtagelse af reagenser, nedsat reaktionstid, minimeret spild og hurtig diffusion¹⁴. Disse egenskaber gør dem lovende platforme for at undersøge lægemiddeltoksicitet, virkning og farmakokinetik. Men udfordringerne ved effektiv, kvantificerbar, reproducerbare og brugervenlig 3D-cellekultur samt, voluminøse og dyre pumpesystemer har begrænsede mikrofluidiske applikationer i forskning med høj gennemløb¹⁰. Effektive detekterings opsætninger og potentielt vanskelige gennemførelse på tværs af felter har også forhindret udbredt anvendelse af mikrofluidisk-systemer¹⁰.

I modsat, sfæroider genereret i ikke-vedhængende forhold i roterende blandere (nutatorer), ultra-lav vedhæftnings plader og hængende dråber omfatter ikke brugerdefinerede matrixkomponenter. Disse metoder er især relevante for studiet af kræft i æggestokkene, da de ikke-overliggende betingelser er repræsentative for de tilstande, hvor sfæroider vokser inden for bughulen⁵. Inden for disse ikke-vedhængende dyrkningsmetoder har nutator og hængende dråbe sfæroider vist sig at udvise højere komprimering, remodeling og chemoresistance sammenlignet med sfæroider genereret i ultra-lave fastgørelses plader, hvilket tyder på øget fysiologisk relevans^16,17,18,19. På grund af øget kapacitet til høj gennemløbs screening fra mindre brønd størrelser og minimale påkrævede cellenumre er sfæroide-generering i hængende dråbe plader en ideel platform til lægemiddel screening. Her præsenterer vi en tunable 3D fysiologisk platform i 384-godt hængende dråbe plader, der er let at implementere og meget modtagelig for downstream analyse, hvilket gør det ideelt til høj gennemløb Drug screening af kræft i æggestokkene og æggestokkene CSCs.

Vores 3D fysiologisk platform giver alle fordelene ved 3D-kultur, herunder fysiologiske celle celle kontakter, diffusions gradienter, celle tætheder og naturligt producerede ECM-proteiner, som kan bidrage til realistiske lægemiddel responser^{16, 17,18,19}. Desuden, ved at generere disse sfæroider med patient-afledte CSCs, vi er i stand til at bestemme patientens specifikke respons på narkotika¹ med mange tekniske replikater samtidig, at overvinde heterogenitet, der kan findes inden patient tumor prøver²⁰. Desuden, 3D kultur har vist sig at øge vedligeholdelsen af CSC populationer^3,16 og dermed er repræsentativ for beriget CSC populationer i ascites⁷. Dette kombineret med let downstream analyse, herunder flow flowcytometri analyse af levedygtighed og CSC proportioner giver mulighed for optimal evaluering af CSC målretning Drug effekt. Endelig er denne fysiologiske platform kompatibel med billeddannelse på flere tidspunkter under eksperimentet, evaluering af celledød og-spredning, celle organisering og morfologi med immun histokemi, opløselig signalering med ELISA på konditioneret mellem, celle fænotyper med flow cytometri og genekspression efter PCR.

Protocol

Alle patientprøver indsamles i henhold til en godkendt IRB-protokol fra samtykkende patienter, hvis prøver afidentificeres efter tumor tumor reduktions og ascites-samlingen. 1. generering af Sfæroider fra små Cellenumre i 384-godt hængende dråbe plader Placer den hængende dråbe plade i en sonicator fyldt med steril deioniseret (DI) vand og sonikere i 20 minutter. Med en dykket hånd fjernes pladen fra sonicatoren og vaskes med rindende DI-vand. Lad pladen …

Representative Results

Sfæroider dannet med cellelinjer eller patient afledte CSCs kan dannes med en række små cellenumre inden for hængende dråber (figur 2a). Sfæroider dannes pålideligt med så få som 10 celler pr. brønd, hvilket gør det muligt at bevare sjældne patientprøver. Celler inden for disse sfæroider er omgivet af andre celler i 3 dimensioner, som de ville være in vivo, giver mulighed for fysiologisk celle celle kontakter og diffusion satser. Tumor celler i sfæroider prolifererer forårsa…

Discussion

384-godt hængende drop Plate platform til 3D sfæroide formation er et let implementeret værktøj til enhver cellebiologi eller cancerbiologi Labs. Denne fysiologiske platform muliggør studiet af cellelinjer, samt, primære patientprøver inden for fysiologisk relevante 3D-kulturer samtidig giver mulighed for høj gennemstrømning Drug screening. Platformen sikrer også, at kultur forholdene er meget tunbare, hvilket muliggør stram kontrol over plating tætheder, celle Co-kultur nøgletal, ekstracellulære komponente…

Materials

0.25% trypsin-EDTA	Gibco	ILT25200056
10 mL serological pipet	Fisher Scientific	13-678-11E
10,000 cSt Si oil	Millipore Sigma	63148-62-9	Used to coat spheroid array mold to facilitate removal of tissue processing gels, like Histogel, from the mold.
100 mm tissue culture dish	Thermo Scientific	130182
15 ml conical tube	Celltreat	FL4021
1X DMEM for Serum Free Medium	Gibco	11965-092
1X F12 for Serum Free Medium	Gibco	11765-054
1X phosphate buffered saline (PBS)	Gibco	ILT10010023
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Thermo Fisher	D1306
40 µm filter	Fisher Scientific	22363547
6-well plate	Fisher Scientific	353046
Accutase	Innovative Cell Technologies Inc.	1449	A gentle cell detachment enzyme composed of proteolytic and collagenolytic enzymes.
ACK Lysing Buffer	Thermo Scientific	A1049201
alamarBlue	Invitrogen	DAL1025	Resazurin dye used to measure viability and proliferation of cells based on their ability to reduce resazurin to resorufin, which is highly fluorescent.
ALDEFLUOR assay kit	Stem Cell Tech	1700	Kit to identify stem and progenitor cells that express high levels of aldehyde dehydrogenase , an indicator of cancer stem cells. The kit is composed of ALDEFLUOR Reagent, DEAB, Hydrochloric Acid, Dimethylsulphoxide, and ALDEFLUOR Assay Buffer.
ALDEFLUOR Diethylaminobenzaldehyde (DEAB)	Stem Cell Tech	1705	Diethylaminobenzaldehyde (DEAB) is an inhibitor of ALDH isozymes, used to determine non-specific ALDH staining.
Andor iXon x3 CCD Camera	Oxford Instruments	–
Antibiotics and Antimycotics	Gibco	15240-062
APC-isotype IgG2b	Miltenyi biotec	130-092-217	Isotype control to quantify non-specific staining of IgG2b antibodies.
B27 Supplement	Gibco	17504044
basic Fibroblast Growth Factor	Stem Cell Technologies	78003.1
BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes	Fisher Scientific	14-826-79
BioTek Synergy HT Microplate Reader	BioTek	7091000
CD133-APC	Miltenyi biotec	130-113-184	Fluorescent antibody targeting CD133, a cancer stem cell marker.
cellSens Dimension Software	Olympus
Cisplatin	Sigma-Aldrich	P4394	Platinum based chemotherapy agent that functions as an alkylating agent that disrupts DNA.
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Invitrogen	D1306
Epidermal Growth Factor	Gibco	PHG0311
EVOS XL Core Cell Imaging System	Life Technologies	AME3300
Fetal Bovine Serum – premium (FBS)	Atlanta Biologicals	S11150
Ficoll 400	Sigma-Aldrich	F4375
Hemacytometer	Hausser Scientific	1490
Histogel	Thermo Scientific	HG-4000-012	Tissue processing gel that can penetrate and hold the specimen within the gel while preventing discoloration around the specimen upon staining.
Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells	Lonza	PT-5006
Human Microvascular Endothelial Cells	Lonza	CC2543
Insulin-Transferrin-Selenium Supplement	Gibco	51500-056
Live/Dead viability kit	Invitrogen	L3224	Kit for the fluorescence based detection of live (calcein-AM) and dead cells (Ethidium Homodimer-1).
MEM Non-essential Amino Acids	Gibco	11140-050
MetaMorph 7.8 Software	Molecular Devices	–
Olympus IX81 Inverted Confocal Microscope	Olympus	–
Olympus IX83 Research Inverted Microscope	Olympus
Parafilm M	Thomas Scientific	7315D35	Thermoplastic polymer strips that serve to limit droplet evaporation in hanging drop plates while still allowing for gas exchange.
Perfecta 3D 384 Well Hanging Drop Plates	3D Biomatrix	HDP1384-8	Available through Sigma-Aldrich
phalloidin AlexaFluor488	Invitrogen	A12379	Phalloidin is a peptide to fluorescently label F-actin in fixed cells.
ProJet 3500 HD Max	3D Systems	–	3D printer
Sterile DI water	Fisher Scientific	353046
Trypan Blue	Gibco	15250061	Azo dye used to differentiate between live and dead cells based on its ability to pass through the damaged membrane of dead cells, but not the intact membrane of live cells.
VisiJet M3 Crystal	3D Systems	–	A biocompatible polymer material for 3D printing.
Yokogawa CSU-X1 Confocal Scanner Unit	Yokogawa	–