Patients physiologiques dérivés sphéroïdes 3D pour le dépistage des médicaments anti-néoplastiques pour cibler les cellules souches cancéreuses
Summary
Ce protocole décrit la génération des sphéroïdes patients-dérivés, et l’analyse en aval comprenant la quantification de la prolifération, l’essai de cytotoxicité, la cytométrie de flux, la coloration d’immunofluorescence et l’imagerie confocale, afin d’évaluer le médicament potentiel des candidats en tant que thérapeutique anti-néoplastique. Ce protocole soutient la médecine de précision avec l’identification de médicaments spécifiques pour chaque patient et stade de la maladie.
Abstract
Dans ce protocole, nous décrivons la procédure pour la génération des sphéroïdes de tumeur dans les gouttelettes de 384-puits pendantes pour permettre le criblage à haut débit des thérapies anticancéreuses dans un microenvironnement physiologiquement représentatif. Nous décrivons la formation des sphéroïdes dérivés de cellules souches de cancer de patient, aussi bien que, la manipulation de ces sphéroïdes pour l’analyse complète suivant le traitement de drogue. Plus précisément, nous décrivons la collection de la morphologie sphéroïde, la prolifération, la viabilité, la toxicité des médicaments, le phénotype cellulaire et les données de localisation cellulaire. Ce protocole se concentre fortement sur les techniques d’analyse qui sont facilement mises en œuvre à l’aide de la plate-forme de 384 puits de chute suspendue, ce qui le rend idéal pour le dépistage des médicaments à haut débit. Bien que nous soulignions l’importance de ce modèle dans les études sur le cancer de l’ovaire et la recherche sur les cellules souches du cancer, la plate-forme de 384 puits est propice à la recherche sur d’autres types de cancer et modèles de maladies, étendant ainsi l’utilité de la plate-forme à de nombreux domaines. En améliorant la vitesse du dépistage personnalisé des médicaments et la qualité des résultats du dépistage grâce à des cultures 3D facilement représentatives sur le plan physiologique, cette plate-forme devrait faciliter le développement de nouvelles thérapies et de cultures spécifiques aux patients. d’un impact clinique de grande envergure.
Introduction
La mortalité liée au cancer dans le monde a atteint un bilan de 9,8 millions de décès en 20181, soulignant la nécessité de développer des thérapies améliorées. Malheureusement, le coût du développement de médicaments contre le cancer augmente, la mise au point d’un seul médicament coûtant environ 650 millions de dollars US2 indiquant la nécessité d’améliorer les stratégies pour mettre au point de nouveaux médicaments anticancéreux. Les cellules souches cancéreuses (CSC), qui sont caractérisées par une chimiorésistance accrue3, la capacité d’auto-renouvellement, et la capacité de semer de nouvelles tumeurs4 sont pensés pour être responsables de la récurrence tumorale4, métastes5, et chemoresistance4,6, qui contribuent tous à la capacité maligne de la tumeur et donc le nombre élevé de décès. Dans le cancer de l’ovaire, ces cellules se trouvent enrichies dans le liquide ascites malins dans la cavité péritonéale, une condition associée à de mauvais résultats cliniques1. En raison des capacités malignes des CSC, on a tenté de mettre au point de nouveaux médicaments ciblant le SCC à utiliser en conjonction avec les chimiothérapies traditionnelles. Plusieurs défis accompagnent le développement de médicaments ciblant le SCC, notamment : 1) la difficulté d’étendre et de maintenir les CSC in vitro; 2) rareté des échantillons de patients; 3) pertinence physiologique de la plate-forme culturelle; et 4) hétérogénéité dans la sensibilité des médicaments entre les patients. Ce protocole décrit la mise en œuvre d’une plate-forme de culture 3D à haut débit qui peut surmonter chacun de ces défis. En particulier, ce système permet un dépistage rapide des médicaments à l’aide d’un petit nombre de CSC ovariens d’origine du patient, et est très favorable aux techniques d’analyse en aval. Bien qu’idéale pour l’étude du cancer de l’ovaire et des CCS, notre plate-forme est également utile pour étudier d’autres cancers et types de cellules différenciées dans des environnements 3D complexes.
Les modèles tridimensionnels complexes (3D) sont essentiels dans l’étude du microenvironnement tumoral (TME), qui est une niche 3D composée de cellules cancéreuses, de cellules de soutien non cancéreuses et de protéines de matrice extracellulaire (ECM)4. Cet environnement 3D se traduit par une morphologie cellulaire unique, des interactions cellule-cellule et cellule-matrice, la différenciation cellulaire, la migration cellulaire, la densité cellulaire et les gradients de diffusion par rapport à la culture cellulaire 2D traditionnelle in vitro4. Tous ces facteurs aboutissent à une réponse différentielle des médicaments dans les cultures 3D, montrant une résistance accrue aux médicaments et une pertinence physiologique7,8. En raison du rôle du TME 3D dans la différenciation et la chimiorésistance du SCC, il est essentiel de dépister les médicaments ciblant le SCC dans les microenvironnements physiologiques. L’amélioration de la pertinence physiologique des plateformes de dépistage des médicaments du SCC a le potentiel d’améliorer le dépistage des médicaments par les patients, le développement de médicaments, la formulation de stratégies de traitement et, en fin de compte, les résultats cliniques. Il est tout aussi important que la plate-forme utilisée pour le dépistage des médicaments soit à haut débit et compatible avec les méthodes d’analyse en aval afin de minimiser le coût, le temps et le temps de traduction clinique des médicaments prometteurs9.
Actuellement, le TME complexe est le meilleur maintenu pour des applications de criblage de drogue par des modèles in vivo tels que des modèles syngénéiques de tumeur murine, les xénogreffes de ligne cellulaire-dérivées, et les modèles de xénogreffe patient-dérivé (PDX)12,car ils fournissent physiologique Conditions. Cependant, la nature à faible débit de ces modèles, ainsi que le coût, le temps et les compétences techniques dont ils ont besoin limitent leur utilité dans les applications rapides et à haut débit de dépistage des médicaments13. Comme alternatives à ces modèles in vivo, de nombreux modèles 3D in vitro utilisant des hydrogels8, la culture dans les dispositifs microfluidiques ou «organe sur puce» dispositifs10,14, et les cultures non-adhérents3,8 ont également été développés, en raison de leur faible obstacle à l’entrée en termes de coût, de temps et de compétences requises.
Les plates-formes de culture hydrogel sont avantageuses dans le contrôle fin accordé sur la composition de matrice, les propriétés mécaniques, et la structure de matrice15; cependant, ils peuvent inhiber la culture cellulaire de haute densité14. En outre, la récolte des cellules à partir d’hydrogels peut compliquer l’analyse en aval, en raison des effets potentiellement nocifs des méthodes de récolte15. Les dispositifs microfluidiques, d’autre part, sont des dispositifs à micro-échelle qui permettent la détection de sortie dans le même dispositif et pour la culture cellulaire à des échelles physiologiquement pertinentes avec une consommation minimale de réactifs, diminution du temps de réaction, minimisation des déchets, et diffusion rapide14. Ces caractéristiques en font des plates-formes prometteuses pour étudier la toxicité, l’efficacité et la pharmacocinétique des médicaments. Cependant, les défis de la culture de cellules 3D efficaces, quantifiables, reproductibles et conviviales, ainsi que des systèmes de pompage volumineux et coûteux ont restreint les applications microfluidiques dans la recherche à haut débit10. Des configurations de détection efficaces et une mise en œuvre potentiellement difficile dans tous les domaines ont également entravé l’adoption généralisée de systèmes microfluidiques10.
En revanche, les sphéroïdes générés dans des conditions non adhérentes dans les mélangeurs rotatifs (nutators), les plaques d’attachement ultra-faibles et les gouttelettes suspendues n’incluent pas les composants de matrice définis par l’utilisateur. Ces méthodologies sont particulièrement pertinentes pour l’étude du cancer de l’ovaire car les conditions non adhérentes sont représentatives des conditions dans lesquelles les sphéroïdes se développent dans la cavité péritonéale5. Dans ces méthodes de culture non-adhérentes, les sphéroïdes de goutte de nutator et de pendaison ont été montrés pour montrer le compaction plus élevé, le remodelage, et la chimiorésistance comparés aux sphérooïdes produits dans les plaques d’attachement ultra-faibles, suggérant physiologique accru pertinence16,17,18,19. En raison de la capacité accrue pour le dépistage à haut débit à partir de plus petites tailles de puits et le nombre minimal requis de cellules, la génération de sphéroïdes dans les plaques de chute suspendues est une plate-forme idéale pour le criblage de drogue. Ici, nous présentons une plate-forme physiologique 3D réglable dans les plaques de chute suspendues de 384 puits, qui est facile à mettre en œuvre et très favorable à l’analyse en aval, ce qui le rend idéal pour le dépistage à haut débit des médicaments contre le cancer de l’ovaire et les CSC ovariens.
Notre plate-forme physiologique 3D fournit tous les avantages de la culture 3D, y compris les contacts physiologiques de cellules-cellules, les gradients de diffusion, les densités de cellules, et les protéines naturellement produites d’ECM, qui peuvent contribuer aux réponses réalistes de drogue16, 17,18,19. En outre, en générant ces sphéroïdes avec les CSC patients-dérivés, nous sommes en mesure de déterminer des réponses spécifiques du patient aux médicaments1 avec de nombreuses répliques techniques simultanément, pour surmonter l’hétérogénéité qui peut être trouvée dans la tumeur patiente échantillons20. En outre, la culture 3D a été montré pour améliorer le maintien des populations csc3,16 et est donc représentatif des populations enrichies CSC dans les ascites7. Ceci combiné à une analyse facile en aval, y compris l’analyse de la cytométrie des débits de viabilité et les proportions du SCC, permet une évaluation optimale de l’efficacité du sCC ciblant les médicaments. Enfin, cette plate-forme physiologique est compatible avec l’imagerie à plusieurs moments au cours de l’expérience, l’évaluation de la mort cellulaire et la prolifération, l’organisation cellulaire et la morphologie avec immunohistochimie, la signalisation soluble avec ELISA sur conditionné phénotypes moyens, cellulaires avec cytométrie de flux, et expression de gène suivant PCR.
Protocol
Representative Results
Discussion
La plate-forme de plaque de chute suspendue de 384 puits pour la formation sphéroïde 3D est un outil facile à implémenter pour n’importe quel laboratoire de biologie cellulaire ou de biologie du cancer. Cette plate-forme physiologique permet l’étude des lignées cellulaires, ainsi que des échantillons de patients primaires dans des cultures 3D physiologiquement pertinentes tout en permettant le dépistage à haut débit des médicaments. La plate-forme garantit également que les conditions de culture sont très r?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail est soutenu principalement par DOD OCRP Early Career Investigator Award W81XWH-13-1-0134(GM), DOD Pilot award W81XWH-16-1-0426 (GM), DOD Investigator Initiated award W81XWH-17-OCRP-IIRA (GM), Rivkin Center for Ovarian Cancer and Michigan Ovarian Cancer alliance. La recherche rapportée dans cette publication a été soutenue par l’Institut national du cancer des Instituts nationaux de la santé sous le numéro de récompense P30CA046592. Le CMN est appuyé par la Bourse de recherche des diplômés de la National Science Foundation dans le cadre de la subvention no 1256260. Le MEB est soutenu par le Département de l’aide aux diplômés du ministère de l’Éducation dans les domaines de la bourse des besoins nationaux (GAANN).
Materials
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco | ILT25200056 | |
| 10 mL serological pipet | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| 10,000 cSt Si oil | Millipore Sigma | 63148-62-9 | Used to coat spheroid array mold to facilitate removal of tissue processing gels, like Histogel, from the mold. |
| 100 mm tissue culture dish | Thermo Scientific | 130182 | |
| 15 ml conical tube | Celltreat | FL4021 | |
| 1X DMEM for Serum Free Medium | Gibco | 11965-092 | |
| 1X F12 for Serum Free Medium | Gibco | 11765-054 | |
| 1X phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | ILT10010023 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher | D1306 | |
| 40 µm filter | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 6-well plate | Fisher Scientific | 353046 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies Inc. | 1449 | A gentle cell detachment enzyme composed of proteolytic and collagenolytic enzymes. |
| ACK Lysing Buffer | Thermo Scientific | A1049201 | |
| alamarBlue | Invitrogen | DAL1025 | Resazurin dye used to measure viability and proliferation of cells based on their ability to reduce resazurin to resorufin, which is highly fluorescent. |
| ALDEFLUOR assay kit | Stem Cell Tech | 1700 | Kit to identify stem and progenitor cells that express high levels of aldehyde dehydrogenase , an indicator of cancer stem cells. The kit is composed of ALDEFLUOR Reagent, DEAB, Hydrochloric Acid, Dimethylsulphoxide, and ALDEFLUOR Assay Buffer. |
| ALDEFLUOR Diethylaminobenzaldehyde (DEAB) | Stem Cell Tech | 1705 | Diethylaminobenzaldehyde (DEAB) is an inhibitor of ALDH isozymes, used to determine non-specific ALDH staining. |
| Andor iXon x3 CCD Camera | Oxford Instruments | – | |
| Antibiotics and Antimycotics | Gibco | 15240-062 | |
| APC-isotype IgG2b | Miltenyi biotec | 130-092-217 | Isotype control to quantify non-specific staining of IgG2b antibodies. |
| B27 Supplement | Gibco | 17504044 | |
| basic Fibroblast Growth Factor | Stem Cell Technologies | 78003.1 | |
| BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes | Fisher Scientific | 14-826-79 | |
| BioTek Synergy HT Microplate Reader | BioTek | 7091000 | |
| CD133-APC | Miltenyi biotec | 130-113-184 | Fluorescent antibody targeting CD133, a cancer stem cell marker. |
| cellSens Dimension Software | Olympus | ||
| Cisplatin | Sigma-Aldrich | P4394 | Platinum based chemotherapy agent that functions as an alkylating agent that disrupts DNA. |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| Epidermal Growth Factor | Gibco | PHG0311 | |
| EVOS XL Core Cell Imaging System | Life Technologies | AME3300 | |
| Fetal Bovine Serum – premium (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Ficoll 400 | Sigma-Aldrich | F4375 | |
| Hemacytometer | Hausser Scientific | 1490 | |
| Histogel | Thermo Scientific | HG-4000-012 | Tissue processing gel that can penetrate and hold the specimen within the gel while preventing discoloration around the specimen upon staining. |
| Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells | Lonza | PT-5006 | |
| Human Microvascular Endothelial Cells | Lonza | CC2543 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium Supplement | Gibco | 51500-056 | |
| Live/Dead viability kit | Invitrogen | L3224 | Kit for the fluorescence based detection of live (calcein-AM) and dead cells (Ethidium Homodimer-1). |
| MEM Non-essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | |
| MetaMorph 7.8 Software | Molecular Devices | – | |
| Olympus IX81 Inverted Confocal Microscope | Olympus | – | |
| Olympus IX83 Research Inverted Microscope | Olympus | ||
| Parafilm M | Thomas Scientific | 7315D35 | Thermoplastic polymer strips that serve to limit droplet evaporation in hanging drop plates while still allowing for gas exchange. |
| Perfecta 3D 384 Well Hanging Drop Plates | 3D Biomatrix | HDP1384-8 | Available through Sigma-Aldrich |
| phalloidin AlexaFluor488 | Invitrogen | A12379 | Phalloidin is a peptide to fluorescently label F-actin in fixed cells. |
| ProJet 3500 HD Max | 3D Systems | – | 3D printer |
| Sterile DI water | Fisher Scientific | 353046 | |
| Trypan Blue | Gibco | 15250061 | Azo dye used to differentiate between live and dead cells based on its ability to pass through the damaged membrane of dead cells, but not the intact membrane of live cells. |
| VisiJet M3 Crystal | 3D Systems | – | A biocompatible polymer material for 3D printing. |
| Yokogawa CSU-X1 Confocal Scanner Unit | Yokogawa | – |
References
- . . All cancers Source: Globocan. , (2018).
- Prasad, V., Mailankody, S. Research and Development Spending to Bring a Single Cancer Drug to Market and Revenues After Approval. JAMA Internal Medicine. 177, 1569-1575 (2017).
- Raghavan, S., et al. Personalized Medicine Based Approach to Model Patterns of Chemoresistance and Tumor Recurrence Using Ovarian Cancer Stem Cell Spheroids. Clinical Cancer Research. 23 (22), 6934-6945 (2017).
- Jordan, C. T., Guzman, M. L., Noble, M. Cancer Stem Cells. New England Journal of Medicine. 355, 1253-1261 (2006).
- Ishiguro, T., et al. Establishment and Characterization of an In Vitro Model of Ovarian Cancer Stem-like Cells with an Enhanced Proliferative Capacity. Recherche en cancérologie. 76, 150-160 (2016).
- Páez, D., et al. Cancer Dormancy: A Model of Early Dissemination and Late Cancer Recurrence. Clinical Cancer Research. 18, 645-653 (2012).
- Ahmed, N., Stenvers, K. L. Getting to Know Ovarian Cancer Ascites: Opportunities for Targeted Therapy-Based Translational Research. Frontiers in Oncology. 3, (2013).
- Pradhan, S., Clary, J. M., Seliktar, D., Lipke, E. A. A three-dimensional spheroidal cancer model based on PEG-fibrinogen hydrogel microspheres. Biomaterials. 115, 141-154 (2017).
- Varna, M., Bertheau, P., Legrès, L. Tumor Microenvironment in Human Tumor Xenografted Mouse Models. Journal of Analytical Oncology. 3, 159-166 (2014).
- Huang, S. B., et al. An integrated microfluidic cell culture system for high-throughput perfusion three-dimensional cell culture-based assays: Effect of cell culture model on the results of chemosensitivity assays. Lab on a Chip. 13, 1133-1143 (2013).
- Zang, R., Li, D., Tang, I. C., Wang, J., Yang, S. T. Cell-Based Assays in High-Throughput Screening for Drug Discovery. International Journal of Biotechnology for Wellness Industries. , (2012).
- Murphy, B., et al. Evaluation of alternative in vivo drug screening methodology: a single mouse analysis. Recherche en cancérologie. 76, 5798-5809 (2016).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived Xenograft models: An emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4, 998-1013 (2014).
- Damiati, S., Kompella, U. B., Damiati, S. A., Kodzius, R. Microfluidic devices for drug delivery systems and drug screening. Genes. 9, (2018).
- Caliari, S. R., Burdick, J. A. A Practical Guide to Hydrogels for Cell Culture. Nature Methods. 14, 69-81 (2016).
- Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy. Journal of Control Release. , (2012).
- Mehta, P., Novak, C., Raghavan, S., Ward, M., Mehta, G., Papaccio, G., Desiderio, V. Self-Renewal and CSCs In Vitro Enrichment: Growth as Floating Spheres. Cancer Stem Cells: Methods and Protocols. , 61-75 (2018).
- Raghavan, S., et al. Formation of stable small cell number three-dimensional ovarian cancer spheroids using hanging drop arrays for preclinical drug sensitivity assays. Gynecologic Oncology. 138, 181-189 (2015).
- Raghavan, S., et al. Comparative analysis of tumor spheroid generation techniques for differential in vitro drug toxicity. Oncotarget. 7, 16948-16961 (2016).
- Kim, S., et al. Evaluating Tumor Evolution via Genomic Profiling of Individual Tumor Spheroids in a Malignant Ascites. Scientific Reports. 8, 1-11 (2018).
- Silva, I. A., et al. Aldehyde dehydrogenase in combination with CD133 defines angiogenic ovarian cancer stem cells that portend poor patient survival. Recherche en cancérologie. 71, 3991-4001 (2011).
- Pulaski, H. L., et al. Identifying alemtuzumab as an anti-myeloid cell antiangiogenic therapy for the treatment of ovarian cancer. Journal of Translational Medicine. 7, 49 (2009).
- Jager, L. D., et al. Effect of enzymatic and mechanical methods of dissociation on neural progenitor cells derived from induced pluripotent stem cells. Advances in Medical Sciences. 61, 78-84 (2016).
- Ivanov, D. P., Grabowska, A. M. Spheroid arrays for high-throughput single-cell analysis of spatial patterns and biomarker expression in 3D. Scientific Reports. 7, 41160 (2017).
