החולה הפיזיולוגי הנגזרות 3D Spheroids עבור הקרנת תרופות אנטי-נאופלסטית כדי למקד את תאי גזע הסרטן
Summary
פרוטוקול זה מתאר את הדור של מטופלים שמקורם בחולים, וניתוח במורד הזרם כולל כימות של התפשטות, בדיקות ציטורעילות, הזרמת cy, כתמים והדמיה מיקוד, על מנת להעריך את התרופה פוטנציאל המועמדים כtherapeutics אנטינאופלסטית. פרוטוקול זה תומך ברפואה מדויקת עם זיהוי תרופות ספציפיות לכל מטופל ולשלב המחלה.
Abstract
בפרוטוקול זה, אנו מתווה את ההליך עבור הדור של spheroids הגידול בתוך 384-היטב לתלות טיפות כדי לאפשר הקרנת תפוקה גבוהה של אנטי סרטניים therapeutics ב מיקרוסביבה ייצוגית מבחינה פיזיולוגית. אנו מתווה את היווצרות של החולה הנגזר הטיפול בתאי גזע הסרטן, כמו גם, מניפולציה של הספרואידים האלה לניתוח מעמיק לאחר טיפולי התרופה. באופן ספציפי, אנו מתארים אוסף של מורפולוגיה ספרואידית, התפשטות, יכולת הרעילות, הרעלת סמים, תאים ומידע לוקליזציה של תאים. פרוטוקול זה מתמקד באופן מעמיק בטכניקות ניתוח אשר מיושמות בקלות באמצעות פלטפורמת הירידה 384-היטב תלויה, מה שהופך אותו אידיאלי עבור הקרנת תרופות בתפוקה גבוהה. בעוד אנו מדגישים את החשיבות של המודל הזה בלימודי סרטן השחלות ומחקר תאי גזע הסרטן, הפלטפורמה 384-ובכן היא קלה למחקר של סוגי סרטן אחרים ודגמי מחלות, הארכת השירות של הפלטפורמה לתחומים רבים. על-ידי שיפור המהירות של הקרנת תרופות מותאמת אישית ואיכות תוצאות ההקרנה באמצעות מיושם בקלות בתרבויות תלת-ממד של נציג מבחינה פיזיולוגית, פלטפורמה זו צפויה לסייע בפיתוח של therapeutics חדש וספציפי למטופל אסטרטגיות טיפול, ולכן יש להם השפעה קלינית רחבה.
Introduction
התמותה ברחבי העולם הקשורות לסרטן הגיעו לאגרה של 9,800,000 מקרי מוות ב 20181, הדגשת הצורך בפיתוח של therapeutics משופרת. למרבה הצער, העלות של פיתוח תרופות לסרטן גדל, עם התפתחות של תרופה אחת עולה כ 650,000,000 USD2 המציין את הצורך אסטרטגיות משופרות כדי לפתח תרופות נגד סרטן חדש. תאי גזע הסרטן (CSCs), אשר מאופיינים על ידי מוגבר הגברת העמידה3, את היכולת לחדש את העצמי, ואת היכולת זרע גידולים חדשים4 נחשבים להיות אחראים להישנות הגידול4, גרורות5, ו מספר4,6, אשר כל לתרום לקיבולת ממאירה של הגידול ולכן מחיר המוות הגבוה. בסרטן השחלות, תאים אלה נמצאים מועשר בנוזל מיימת ממאיר בחלל הצפק, מצב הקשור עם תוצאות קליניות עניים1. כתוצאה מיכולות ממאירות של CSCs, יש כבר דחיפה לפתח תרופות חדשות CSC המטרה להשתמש בשילוב עם כימותרפיות מסורתיות. ישנם מספר אתגרים המלווים את הפיתוח של CSC מיקוד תרופות כולל: 1) קושי להרחיב ולשמור על CSCs in מבחנה; 2) מחסור בדגימות מטופלים; 3) הרלוונטיות הפיזיולוגית של פלטפורמת התרבות; ו-4) טרוגניות ברגישות לסמים בין המטופלים. פרוטוקול זה מתאר את היישום של פלטפורמת תרבות תלת-ממד בתפוקה גבוהה שיכולה להתגבר על כל אחד מהאתגרים הללו. בפרט, מערכת זו מאפשרת סינון סמים מהיר באמצעות מספרים קטנים של החולה נגזר CSCs השחלות, והוא קל מאוד לניתוח שיטות במורד הזרם. בעוד אידיאלי ללמוד סרטן השחלות ו CSCs, הפלטפורמה שלנו הוא גם בעל ערך בלמידה סרטן אחרים וסוגי תאים הבדיל בסביבות 3D מורכבות.
מורכב תלת מימדי (3D) מודלים הם קריטיים ללמוד מיקרוסביבה הגידול (TME), שהיא נישה 3D מורכב של תאים סרטניים, תאים שאינם סרטניים תמיכה, ו מטריצה החילוץ (ECM) חלבונים4. סביבה תלת-ממדית זו יוצרת מורפולוגיה של תאים ייחודיים, תאי תא ואינטראקציות של מטריצות תאים, בידול תאים, העברת תאים, צפיפות תאים ומעברי דיפוזיה לעומת תרבות תא דו-ממדית מסורתית במבחנה4. כל הגורמים הללו להיות בתגובה תרופה דיפרנציאלית בתוך התרבויות 3d, מציג עמידות לסמים מוגברת רלוונטיות פיזיולוגית7,8. בשל התפקיד של TME 3D בידול CSC ומורשת, זה חיוני על המסך עבור תרופות מיקוד CSC ב מיקרו סביבות פיזיולוגית. שיפור הרלוונטיות הפיזיולוגית של פלטפורמות הסינון התרופתי של CSC יש את הפוטנציאל לשפר את הטיפול בתרופות ספציפיות המטופל, פיתוח התרופה, ניסוח אסטרטגיות ריפוי, ובסופו של דבר תוצאות קליניות. חשוב באותה מידה כי הפלטפורמה המשמשת עבור הקרנת התרופה להיות בתפוקה גבוהה ותואם לשיטות ניתוח במורד הזרם כדי למזער עלות, זמן, ותרגום קליני של תרופות מבטיחות9.
כיום, TME מורכבים מתוחזק בצורה הטובה ביותר עבור יישומים הקרנת סמים דרך מודלים vivo כגון מודלים הגידול מורגית syngeneic, קו הנגזרות xenografts, ואת החולה נגזר xenografts שתל (PDX) מודלים12, כפי שהם מספקים פיזיולוגי תנאים. עם זאת, התפוקה הנמוכה של מודלים אלה, כמו גם, עלות, זמן, ומיומנות טכנית קובע כי הם דורשים מגבלות השירות שלהם במהירות, תפוקה גבוהה של העברת תרופות ביישומים13. כמו חלופות אלה במודלים vivo, רבים מודלים תלת-ממדיים מחוץ למים ניצול הידרוג’ל8, תרבות בתוך התקנים microflu, או “עוגב-on-a-שבב” מכשירים10,14, ותרבויות לא חסיד3,8 פותחו גם הם, בשל המכשול הנמוך שלהם לערך במונחים של עלות, זמן ומושגי חובה.
פלטפורמות תרבות הידרוג’ל מועילים לשליטה העדינה הניתנת על הרכב המטריקס, תכונות מכניות ומבנה מטריצה15; עם זאת, הם יכולים לעכב את תרבות התא בצפיפות גבוהה14. בנוסף, לאסוף תאים מהידרוג יכול לסבך את ניתוח במורד הזרם, בשל השפעות מזיקות פוטנציאלי של שיטות הקציר15. מכשירים זעירים, מצד שני, הם התקנים microscale המאפשרים זיהוי פלט בתוך אותו התקן ועבור תרבות התא בסולמות הרלוונטיים מבחינה פיזיולוגית עם צריכה מינימלית של ריאגנטים, ירידה זמן התגובה, ממוזער פסולת, ו דיפוזיה מהירה14. מאפיינים אלה גורמים להם פלטפורמות מבטיחות לחקירת רעילות, יעילות ופרמקוקינטיקה של סמים. עם זאת, האתגרים של יעיל, ככמת, הניתנות לכימות, ואת ידידותי למשתמש התרבות התא 3D, כמו גם, מערכות שאיבה מגושם ויקר יש מוגבלת יישומים microfluidic במחקר תפוקה גבוהה10. כיוונוני זיהוי יעילים והטמעה בלתי-מסובכת של שדות, הפריע גם לאימוץ נרחב של מערכות microfluidic10.
מבחינה כוללת, שנוצרו בתנאים שאינם מחוללים באמצעות מיקסרים מסתובבים (פסיכים), לוחות קבצים מצורפים אולטרה-נמוכים וטיפות תלויות אינן כוללות רכיבי מטריצה המוגדרים על-ידי המשתמש. מתודולוגיות אלה רלוונטיות במיוחד לחקר סרטן השחלות כמו תנאים שאינם חסיד מייצגים את התנאים בהם הספרואידים לצמוח בתוך חלל הצפק5. בתוך אלה שיטות התרבות שאינם חסיד, שחרור ותליית השחרור התלויים הוכחו התערוכה דחיסה גבוהה יותר, שיפוץ, ו cheמטרות לעומת spheroids שנוצרו לוחיות מצורף אולטרה נמוך, הרומז פיסיולוגיים מוגברת . רלוונטיות16,17,18,19 בשל קיבולת מוגברת עבור הקרנת תפוקה גבוהה מפני גדלים קטנים ומזעריים מספרי תאים נדרשים, הדור ספרואיד בלוחות השחרור תלויה היא פלטפורמה אידיאלית עבור הקרנת סמים. כאן, אנו מציגים פלטפורמת הפיזיולוגית תלת-ממדית של 3D ב 384-ובכן תלויים לוחיות הירידה, כי הוא קל ליישם מאוד קלה לניתוח במורד הזרם, מה שהופך אותו אידיאלי עבור הקרנת סמים בתפוקה גבוהה של סרטן השחלות השחלות CSCs.
פלטפורמת הפיזיולוגית תלת-ממדית שלנו מספקת את כל היתרונות של תרבות תלת-ממדית, כולל אנשי קשר פיזיולוגיים של תאי תא, הדרגתיות במעברי הצבע, צפיפות התא וחלבונים ECM המיוצרים באופן טבעי, אשר עשויים לתרום לתגובות מציאותיות של תרופות16, 17,18,19. בנוסף, על-ידי הפקת הספרואידים האלה עם CSCs החולה נגזר, אנו מסוגלים לקבוע תגובות ספציפיות למטופל תרופות1 עם משכפל טכני רבים בו, כדי להתגבר על טרוגניות שניתן למצוא בתוך הגידול החולה . דוגמיות של20 יתר על כן, תרבות 3d הוכח לשפר את התחזוקה של אוכלוסיות csc3,16 ולכן הוא נציג של אוכלוסיות csc מועשר בתוך מיימת7. זה משולב עם ניתוח קל במורד הזרם, כולל הניתוח cy, הזרימה האבחון של הכדאיות ואת הפרופורציות CSC מאפשר הערכה אופטימלית של מיקוד יעילות הסמים של CSC. לבסוף, פלטפורמת הפיזיולוגית הזאת תואמת להדמיה בנקודות זמן מרובות במהלך הניסוי, הערכה של מוות והתפשטות תאים, ארגון תאים ומורפולוגיה עם אימונוהיסטוכימיה, איתות מסיסים עם אליסה על ממוזג בינונית, פנוטיפים לתא עם הזרימה cy, וביטוי גנים אחרי ה-PCR.
Protocol
Representative Results
Discussion
384-היטב תלוי הלוח ירידה פלטפורמה עבור היווצרות 3D ספרוoid הוא כלי מיושם בקלות עבור כל ביולוגיה תא או סרטן בביולוגיה מעבדות. זו פלטפורמה פיזיולוגית מאפשר לימוד של קווי התא, כמו גם, דגימות המטופל העיקרי בתוך תרבויות תלת-ממד רלוונטיות מבחינה פיזיולוגית תוך מתן אפשרות הקרנת סמים בתפוקה גבוהה. הפ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת בעיקר על ידי משרד ההגנה OCRP הקריירה המוקדמת הפרס W81XWH-13-1-0134 (GM), משרד ההגנה פרס פיילוט W81XWH-16-1-0426 (GM), משרד ההגנה החוקר יזם הפרס W81XWH-17-OCRP-IIRA (GM), ריבקין מרכז לסרטן השחלות וסרטן השחלות מישיגן ברית. מחקר שדווח בפרסום זה נתמך על ידי המכון הלאומי לסרטן של המוסדות הלאומיים לבריאות תחת מספר הפרס P30CA046592. CMN נתמך על ידי האגודה הלאומית לחקר בוגרי קרן המדע תחת גרנט מס ‘ 1256260. MEB נתמכת על-ידי המחלקה לסיוע בוגר מחלקת החינוך בתחומי הצריכה הלאומית (GAANN).
Materials
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco | ILT25200056 | |
| 10 mL serological pipet | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| 10,000 cSt Si oil | Millipore Sigma | 63148-62-9 | Used to coat spheroid array mold to facilitate removal of tissue processing gels, like Histogel, from the mold. |
| 100 mm tissue culture dish | Thermo Scientific | 130182 | |
| 15 ml conical tube | Celltreat | FL4021 | |
| 1X DMEM for Serum Free Medium | Gibco | 11965-092 | |
| 1X F12 for Serum Free Medium | Gibco | 11765-054 | |
| 1X phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | ILT10010023 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher | D1306 | |
| 40 µm filter | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 6-well plate | Fisher Scientific | 353046 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies Inc. | 1449 | A gentle cell detachment enzyme composed of proteolytic and collagenolytic enzymes. |
| ACK Lysing Buffer | Thermo Scientific | A1049201 | |
| alamarBlue | Invitrogen | DAL1025 | Resazurin dye used to measure viability and proliferation of cells based on their ability to reduce resazurin to resorufin, which is highly fluorescent. |
| ALDEFLUOR assay kit | Stem Cell Tech | 1700 | Kit to identify stem and progenitor cells that express high levels of aldehyde dehydrogenase , an indicator of cancer stem cells. The kit is composed of ALDEFLUOR Reagent, DEAB, Hydrochloric Acid, Dimethylsulphoxide, and ALDEFLUOR Assay Buffer. |
| ALDEFLUOR Diethylaminobenzaldehyde (DEAB) | Stem Cell Tech | 1705 | Diethylaminobenzaldehyde (DEAB) is an inhibitor of ALDH isozymes, used to determine non-specific ALDH staining. |
| Andor iXon x3 CCD Camera | Oxford Instruments | – | |
| Antibiotics and Antimycotics | Gibco | 15240-062 | |
| APC-isotype IgG2b | Miltenyi biotec | 130-092-217 | Isotype control to quantify non-specific staining of IgG2b antibodies. |
| B27 Supplement | Gibco | 17504044 | |
| basic Fibroblast Growth Factor | Stem Cell Technologies | 78003.1 | |
| BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes | Fisher Scientific | 14-826-79 | |
| BioTek Synergy HT Microplate Reader | BioTek | 7091000 | |
| CD133-APC | Miltenyi biotec | 130-113-184 | Fluorescent antibody targeting CD133, a cancer stem cell marker. |
| cellSens Dimension Software | Olympus | ||
| Cisplatin | Sigma-Aldrich | P4394 | Platinum based chemotherapy agent that functions as an alkylating agent that disrupts DNA. |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| Epidermal Growth Factor | Gibco | PHG0311 | |
| EVOS XL Core Cell Imaging System | Life Technologies | AME3300 | |
| Fetal Bovine Serum – premium (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Ficoll 400 | Sigma-Aldrich | F4375 | |
| Hemacytometer | Hausser Scientific | 1490 | |
| Histogel | Thermo Scientific | HG-4000-012 | Tissue processing gel that can penetrate and hold the specimen within the gel while preventing discoloration around the specimen upon staining. |
| Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells | Lonza | PT-5006 | |
| Human Microvascular Endothelial Cells | Lonza | CC2543 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium Supplement | Gibco | 51500-056 | |
| Live/Dead viability kit | Invitrogen | L3224 | Kit for the fluorescence based detection of live (calcein-AM) and dead cells (Ethidium Homodimer-1). |
| MEM Non-essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | |
| MetaMorph 7.8 Software | Molecular Devices | – | |
| Olympus IX81 Inverted Confocal Microscope | Olympus | – | |
| Olympus IX83 Research Inverted Microscope | Olympus | ||
| Parafilm M | Thomas Scientific | 7315D35 | Thermoplastic polymer strips that serve to limit droplet evaporation in hanging drop plates while still allowing for gas exchange. |
| Perfecta 3D 384 Well Hanging Drop Plates | 3D Biomatrix | HDP1384-8 | Available through Sigma-Aldrich |
| phalloidin AlexaFluor488 | Invitrogen | A12379 | Phalloidin is a peptide to fluorescently label F-actin in fixed cells. |
| ProJet 3500 HD Max | 3D Systems | – | 3D printer |
| Sterile DI water | Fisher Scientific | 353046 | |
| Trypan Blue | Gibco | 15250061 | Azo dye used to differentiate between live and dead cells based on its ability to pass through the damaged membrane of dead cells, but not the intact membrane of live cells. |
| VisiJet M3 Crystal | 3D Systems | – | A biocompatible polymer material for 3D printing. |
| Yokogawa CSU-X1 Confocal Scanner Unit | Yokogawa | – |
References
- . . All cancers Source: Globocan. , (2018).
- Prasad, V., Mailankody, S. Research and Development Spending to Bring a Single Cancer Drug to Market and Revenues After Approval. JAMA Internal Medicine. 177, 1569-1575 (2017).
- Raghavan, S., et al. Personalized Medicine Based Approach to Model Patterns of Chemoresistance and Tumor Recurrence Using Ovarian Cancer Stem Cell Spheroids. Clinical Cancer Research. 23 (22), 6934-6945 (2017).
- Jordan, C. T., Guzman, M. L., Noble, M. Cancer Stem Cells. New England Journal of Medicine. 355, 1253-1261 (2006).
- Ishiguro, T., et al. Establishment and Characterization of an In Vitro Model of Ovarian Cancer Stem-like Cells with an Enhanced Proliferative Capacity. Recherche en cancérologie. 76, 150-160 (2016).
- Páez, D., et al. Cancer Dormancy: A Model of Early Dissemination and Late Cancer Recurrence. Clinical Cancer Research. 18, 645-653 (2012).
- Ahmed, N., Stenvers, K. L. Getting to Know Ovarian Cancer Ascites: Opportunities for Targeted Therapy-Based Translational Research. Frontiers in Oncology. 3, (2013).
- Pradhan, S., Clary, J. M., Seliktar, D., Lipke, E. A. A three-dimensional spheroidal cancer model based on PEG-fibrinogen hydrogel microspheres. Biomaterials. 115, 141-154 (2017).
- Varna, M., Bertheau, P., Legrès, L. Tumor Microenvironment in Human Tumor Xenografted Mouse Models. Journal of Analytical Oncology. 3, 159-166 (2014).
- Huang, S. B., et al. An integrated microfluidic cell culture system for high-throughput perfusion three-dimensional cell culture-based assays: Effect of cell culture model on the results of chemosensitivity assays. Lab on a Chip. 13, 1133-1143 (2013).
- Zang, R., Li, D., Tang, I. C., Wang, J., Yang, S. T. Cell-Based Assays in High-Throughput Screening for Drug Discovery. International Journal of Biotechnology for Wellness Industries. , (2012).
- Murphy, B., et al. Evaluation of alternative in vivo drug screening methodology: a single mouse analysis. Recherche en cancérologie. 76, 5798-5809 (2016).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived Xenograft models: An emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4, 998-1013 (2014).
- Damiati, S., Kompella, U. B., Damiati, S. A., Kodzius, R. Microfluidic devices for drug delivery systems and drug screening. Genes. 9, (2018).
- Caliari, S. R., Burdick, J. A. A Practical Guide to Hydrogels for Cell Culture. Nature Methods. 14, 69-81 (2016).
- Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy. Journal of Control Release. , (2012).
- Mehta, P., Novak, C., Raghavan, S., Ward, M., Mehta, G., Papaccio, G., Desiderio, V. Self-Renewal and CSCs In Vitro Enrichment: Growth as Floating Spheres. Cancer Stem Cells: Methods and Protocols. , 61-75 (2018).
- Raghavan, S., et al. Formation of stable small cell number three-dimensional ovarian cancer spheroids using hanging drop arrays for preclinical drug sensitivity assays. Gynecologic Oncology. 138, 181-189 (2015).
- Raghavan, S., et al. Comparative analysis of tumor spheroid generation techniques for differential in vitro drug toxicity. Oncotarget. 7, 16948-16961 (2016).
- Kim, S., et al. Evaluating Tumor Evolution via Genomic Profiling of Individual Tumor Spheroids in a Malignant Ascites. Scientific Reports. 8, 1-11 (2018).
- Silva, I. A., et al. Aldehyde dehydrogenase in combination with CD133 defines angiogenic ovarian cancer stem cells that portend poor patient survival. Recherche en cancérologie. 71, 3991-4001 (2011).
- Pulaski, H. L., et al. Identifying alemtuzumab as an anti-myeloid cell antiangiogenic therapy for the treatment of ovarian cancer. Journal of Translational Medicine. 7, 49 (2009).
- Jager, L. D., et al. Effect of enzymatic and mechanical methods of dissociation on neural progenitor cells derived from induced pluripotent stem cells. Advances in Medical Sciences. 61, 78-84 (2016).
- Ivanov, D. P., Grabowska, A. M. Spheroid arrays for high-throughput single-cell analysis of spatial patterns and biomarker expression in 3D. Scientific Reports. 7, 41160 (2017).
