Paziente fisiologico Derivato da spheroid 3D per lo screening farmacologico anti-neoplastico per colpire le cellule staminali tumorali
Summary
Questo protocollo descrive la generazione di sferoidi derivati dal paziente e l’analisi a valle, tra cui la quantificazione della proliferazione, il test di citotossicità, la citometria di flusso, la colorazione dell’immunofluorescenza e l’imaging confocale, al fine di valutare il farmaco potenziale dei candidati come terapie anti-neoplastiche. Questo protocollo supporta la medicina di precisione con l’identificazione di farmaci specifici per ogni paziente e lo stadio della malattia.
Abstract
In questo protocollo, illustreremo la procedura per la generazione di sferoidi tumorali all’interno di goccioline appese 384-well per consentire lo screening ad alto rendimento delle terapie anti-cancro in un microambiente fisiologicamente rappresentativo. Illustreremo la formazione di sferoidi di cellule staminali tumorali derivati dal paziente, nonché la manipolazione di questi sferoidi per un’analisi approfondita dopo il trattamento farmacologico. In particolare, descriviamo la raccolta di morfologia sferoide, proliferazione, vitalità, tossicità dei farmaci, fenotipo cellulare e dati di localizzazione cellulare. Questo protocollo si concentra fortemente sulle tecniche di analisi che sono facilmente implementabili utilizzando la piattaforma di sospensione a 384 gradi, rendendola ideale per lo screening farmacologico ad alta produttività. Mentre sottolineiamo l’importanza di questo modello negli studi sul cancro ovarico e nella ricerca sulle cellule staminali del cancro, la piattaforma a 384 pozzet è suscettibile alla ricerca di altri tipi di cancro e modelli di malattia, estendendo l’utilità della piattaforma a molti campi. Migliorando la velocità dello screening farmacologico personalizzato e la qualità dei risultati dello screening attraverso colture 3D fisiologicamente rappresentative, questa piattaforma è prevista per aiutare nello sviluppo di nuove terapie e specifiche per il paziente strategie di trattamento, e quindi hanno un impatto clinico di ampia portata.
Introduction
La mortalità legata al cancro in tutto il mondo haraggiunto un numero di 9,8 milioni di decessi nel 2018 1, evidenziando la necessità di migliorare lo sviluppo di migliori terapie. Purtroppo, il costo dello sviluppo di farmaci per il cancro è in aumento, con lo sviluppo di un singolo farmaco che costa circa 650 milioni di dollari2 che indica la necessità di migliori strategie per sviluppare nuovi farmaci anti-cancro. Le cellule staminali tumorali (CSC), caratterizzate da una maggiore chemiostiera3, la capacità di auto-rinnovarsi, e la capacità di semina nuovi tumori4 sono pensati per essere responsabili della ricorrenza tumorale4, metastasi5, e chemoresistance4,6, che contribuiscono tutti alla capacità maligna del tumore e quindi all’alto numero di morti. Nel cancro ovarico, queste cellule si trovano arricchite nel liquido maligno ascite nella cavità peritoneale, una condizione associata a scarsi esiti clinici1. Come risultato delle capacità maligne dei CSC, c’è stata una spinta a sviluppare nuovi farmaci mirati CSC da utilizzare in combinazione con le chemioterapie tradizionali. Ci sono diverse sfide che accompagnano lo sviluppo di farmaci mirati CSC tra cui: 1) difficoltà nell’espansione e nel mantenimento dei CSC in vitro; 2) scarsità di campioni di pazienti; 3) rilevanza fisiologica della piattaforma culturale; e 4) l’eterogeneità nella sensibilità farmacologica tra i pazienti. Questo protocollo descrive l’implementazione di una piattaforma di coltura 3D ad alta velocità effettiva in grado di superare ognuna di queste sfide. In particolare, questo sistema consente uno screening rapido dei farmaci utilizzando un piccolo numero di CSC ovariche derivati dal paziente ed è altamente suscettibile alle tecniche di analisi a valle. Ideali per studiare il cancro ovarico e i CSC, la nostra piattaforma è anche utile nello studio di altri tumori e tipi di cellule differenziate in ambienti 3D complessi.
Modelli tridimensionali complessi (3D) sono fondamentali nello studio del microambiente tumorale (TME), che è una nicchia 3D composta da cellule tumorali, cellule non cancerose e proteine della matrice extracellulare (ECM)4. Questo ambiente 3D si traduce in morfologia cellulare unica, interazioni cell-cell e cell-matrix, differenziazione cellulare, migrazione cellulare, densità cellulare e gradienti di diffusione rispetto alla tradizionale coltura cellulare 2D in vitro4. Tutti questi fattori culminano nella risposta differenziale dei farmaci all’interno delle culture 3D, mostrando una maggiore resistenza ai farmaci e rilevanza fisiologica7,8. A causa del ruolo del TME 3D nella differenziazione e chemioresistance CSC, è fondamentale vagliare farmaci mirati a CSC in microambienti fisiologici. Migliorare la rilevanza fisiologica delle piattaforme di screening farmacologico CSC ha il potenziale per migliorare lo screening farmacologico specifico del paziente, lo sviluppo di farmaci, la formulazione di strategie di trattamento e, in ultima analisi, gli esiti clinici. È altrettanto importante che la piattaforma utilizzata per lo screening farmacologico sia ad alta produttività e compatibile con metodi di analisi a valle per ridurre al minimo i costi, il tempo e il tempo di traduzione clinica dei farmaci promettenti9.
Attualmente, il complesso TME è meglio mantenuto per applicazioni di screening farmacologico attraverso modelli in vivo come modelli di tumore sinogene murinici, xenografi derivati da linee cellulari e modelli di xenotrapianto (PDX) derivati dal paziente12, in quanto forniscono modelli fisiologici Condizioni. Tuttavia, la natura a bassa velocità effettiva di questi modelli, nonché i set di competenze tecniche, tempo e costo che richiedono limitano la loro utilità in applicazioni di screening dei farmaci rapido e ad alta velocità effettiva13. Come alternative a questi modelli in vivo, molti modelli 3D in vitro che utilizzano idrogel8, coltura all’interno di dispositivi microfluidici o dispositivi ‘organ-on-a-chip’10,14e culture non aderenti3,8 sono stati sviluppati, a causa della loro bassa barriera all’ingresso in termini di costi, tempo e competenze richieste.
Le piattaforme di coltura idrogel sono vantaggiose nel controllo fine offerto sulla composizione della matrice, le proprietà meccaniche e la struttura della matrice15; tuttavia, possono inibire la coltura cellulare ad alta densità14. Inoltre, la raccolta di cellule da idrogelpuò può complicare l’analisi a valle, a causa di effetti potenzialmente dannosi dei metodi di raccolta15. I dispositivi microfluidici, d’altra parte, sono dispositivi su microscala che consentono il rilevamento dell’uscita all’interno dello stesso dispositivo e per la coltura cellulare su scale fisiologicamente rilevanti con un consumo minimo di reagenti, tempi di reazione ridotti, sprechi ridotti al minimo e rapida diffusione14. Queste caratteristiche li rendono piattaforme promettenti per studiare la tossicità dei farmaci, l’efficacia e la farmacocinetica. Tuttavia, le sfide di una coltura di cellule 3D efficiente, quantificabile, riproducibile e user-friendly, nonché sistemi di pompaggio ingombranti e costosi, hanno limitato le applicazioni microfluidiche nella ricerca ad alto rendimento10. Le configurazioni di rilevamento efficienti e l’implementazione potenzialmente difficile in tutti i campi hanno anche ostacolato l’adozione diffusa di sistemi microfluidici10.
Al contrario, gli sferoidi generati in condizioni non aderenti nei miscelatori rotanti (nutatori), nelle piastre di fissaggio ultra-basse e nelle goccioline appese non includono componenti di matrice definiti dall’utente. Queste metodologie sono particolarmente rilevanti per studiare il cancro ovarico in quanto le condizioni non aderenti sono rappresentative delle condizioni in cui gli sferoidi crescono all’interno della cavità peritoneale5. All’interno di questi metodi di coltura non aderenti, i nutatoor e gli sferoidi a goccia appesa hanno dimostrato di presentare una maggiore compattazione, rimodellamento e chemioresistance rispetto agli sferoidi generati nelle piastre di attaccamento ultra-basso, suggerendo un aumento fisiologico pertinenza16,17,18,19. A causa della maggiore capacità per lo screening ad alto rendimento da pozzi di dimensioni più piccole e di un numero minimo di celle richiesto, la generazione di sferoidi in piastre appese è una piattaforma ideale per lo screening farmacologico. Qui, vi presentiamo una piattaforma fisiologica 3D regolabile in piastre di goccia appese a 384-pozzo, che è facile da implementare e altamente suscettibile di analisi a valle, che lo rende ideale per lo screening farmacologico ad alta produttività del cancro ovarico e CSC ovarici.
La nostra piattaforma fisiologica 3D offre tutti i vantaggi della coltura 3D, compresi i contatti fisiologici delle cellule cellulari, i gradienti di diffusione, le densità cellulari e le proteine ECM prodotte naturalmente, che possono contribuire a risposte realistiche dei farmaci16, 17,18,19. Inoltre, generando questi sferoidi con CSC derivati dal paziente, siamo in grado di determinare le risposte specifiche del paziente ai farmaci1 con molti repliche tecniche contemporaneamente, per superare l’eterogeneità che può essere trovata all’interno del tumore del paziente campioni20. Inoltre, la cultura 3D ha dimostrato di migliorare la manutenzione delle popolazioni di CSC3,16 e quindi è rappresentativa delle popolazioni arricchite di CSC negli asciti7. Questo combinato con una facile analisi a valle, compresa l’analisi della citometria di flusso della vitalità e delle proporzioni CSC, consente una valutazione ottimale dell’efficacia dei farmaci mirati dal CSC. Infine, questa piattaforma fisiologica è compatibile con l’imaging in più momenti durante l’esperimento, la valutazione della morte e della proliferazione cellulare, l’organizzazione cellulare e la morfologia con immunohistochimica, segnalazione solubile con ELISA su condizionato medio, fenotipi cellulari con citometria di flusso, ed espressione genica dopo PCR.
Protocol
Representative Results
Discussion
La piattaforma di lastra di goccia appesa 384-well per la formazione di sferoidi 3D è uno strumento facilmente implementato per qualsiasi biologia cellulare o laboratori di biologia del cancro. Questa piattaforma fisiologica consente lo studio delle linee cellulari, così come dei campioni di pazienti primari all’interno di colture 3D fisiologicamente rilevanti, consentendo allo stesso tempo uno screening farmacologico ad alto rendimento. La piattaforma assicura inoltre che le condizioni di coltura siano fortemente rego…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è supportato principalmente dal DOD OCRP Early Career Investigator Award W81XWH-13-1-0134(GM), doD Pilot award W81XWH-16-1-0426 (GM), DOD Investigator Initiated award W81XWH-17-OCRP-IIRA (GM), Rivkin Center for Ovarian Cancer and Michigan Ovarian Cancer alleanza. La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata sostenuta dal National Cancer Institute del National Institutes of Health con il numero di premio P30CA046592. CMN è supportato dalla National Science Foundation Graduate Research Fellowship sotto il n. 1256260. MEB è sostenuta dalla borsa di studio del Dipartimento di assistenza universitaria nelle aree di bisogno nazionale (GAANN).
Materials
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco | ILT25200056 | |
| 10 mL serological pipet | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| 10,000 cSt Si oil | Millipore Sigma | 63148-62-9 | Used to coat spheroid array mold to facilitate removal of tissue processing gels, like Histogel, from the mold. |
| 100 mm tissue culture dish | Thermo Scientific | 130182 | |
| 15 ml conical tube | Celltreat | FL4021 | |
| 1X DMEM for Serum Free Medium | Gibco | 11965-092 | |
| 1X F12 for Serum Free Medium | Gibco | 11765-054 | |
| 1X phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | ILT10010023 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher | D1306 | |
| 40 µm filter | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 6-well plate | Fisher Scientific | 353046 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies Inc. | 1449 | A gentle cell detachment enzyme composed of proteolytic and collagenolytic enzymes. |
| ACK Lysing Buffer | Thermo Scientific | A1049201 | |
| alamarBlue | Invitrogen | DAL1025 | Resazurin dye used to measure viability and proliferation of cells based on their ability to reduce resazurin to resorufin, which is highly fluorescent. |
| ALDEFLUOR assay kit | Stem Cell Tech | 1700 | Kit to identify stem and progenitor cells that express high levels of aldehyde dehydrogenase , an indicator of cancer stem cells. The kit is composed of ALDEFLUOR Reagent, DEAB, Hydrochloric Acid, Dimethylsulphoxide, and ALDEFLUOR Assay Buffer. |
| ALDEFLUOR Diethylaminobenzaldehyde (DEAB) | Stem Cell Tech | 1705 | Diethylaminobenzaldehyde (DEAB) is an inhibitor of ALDH isozymes, used to determine non-specific ALDH staining. |
| Andor iXon x3 CCD Camera | Oxford Instruments | – | |
| Antibiotics and Antimycotics | Gibco | 15240-062 | |
| APC-isotype IgG2b | Miltenyi biotec | 130-092-217 | Isotype control to quantify non-specific staining of IgG2b antibodies. |
| B27 Supplement | Gibco | 17504044 | |
| basic Fibroblast Growth Factor | Stem Cell Technologies | 78003.1 | |
| BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes | Fisher Scientific | 14-826-79 | |
| BioTek Synergy HT Microplate Reader | BioTek | 7091000 | |
| CD133-APC | Miltenyi biotec | 130-113-184 | Fluorescent antibody targeting CD133, a cancer stem cell marker. |
| cellSens Dimension Software | Olympus | ||
| Cisplatin | Sigma-Aldrich | P4394 | Platinum based chemotherapy agent that functions as an alkylating agent that disrupts DNA. |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| Epidermal Growth Factor | Gibco | PHG0311 | |
| EVOS XL Core Cell Imaging System | Life Technologies | AME3300 | |
| Fetal Bovine Serum – premium (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Ficoll 400 | Sigma-Aldrich | F4375 | |
| Hemacytometer | Hausser Scientific | 1490 | |
| Histogel | Thermo Scientific | HG-4000-012 | Tissue processing gel that can penetrate and hold the specimen within the gel while preventing discoloration around the specimen upon staining. |
| Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells | Lonza | PT-5006 | |
| Human Microvascular Endothelial Cells | Lonza | CC2543 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium Supplement | Gibco | 51500-056 | |
| Live/Dead viability kit | Invitrogen | L3224 | Kit for the fluorescence based detection of live (calcein-AM) and dead cells (Ethidium Homodimer-1). |
| MEM Non-essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | |
| MetaMorph 7.8 Software | Molecular Devices | – | |
| Olympus IX81 Inverted Confocal Microscope | Olympus | – | |
| Olympus IX83 Research Inverted Microscope | Olympus | ||
| Parafilm M | Thomas Scientific | 7315D35 | Thermoplastic polymer strips that serve to limit droplet evaporation in hanging drop plates while still allowing for gas exchange. |
| Perfecta 3D 384 Well Hanging Drop Plates | 3D Biomatrix | HDP1384-8 | Available through Sigma-Aldrich |
| phalloidin AlexaFluor488 | Invitrogen | A12379 | Phalloidin is a peptide to fluorescently label F-actin in fixed cells. |
| ProJet 3500 HD Max | 3D Systems | – | 3D printer |
| Sterile DI water | Fisher Scientific | 353046 | |
| Trypan Blue | Gibco | 15250061 | Azo dye used to differentiate between live and dead cells based on its ability to pass through the damaged membrane of dead cells, but not the intact membrane of live cells. |
| VisiJet M3 Crystal | 3D Systems | – | A biocompatible polymer material for 3D printing. |
| Yokogawa CSU-X1 Confocal Scanner Unit | Yokogawa | – |
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