がん幹細胞を標的とする抗腫瘍性薬物スクリーニングのための生理学的患者由来3Dスフェロイド
Summary
このプロトコルは、患者由来のスフェロイドの生成、および増殖の定量化、細胞傷害性試験、フローサイトメトリー、免疫蛍光染色および共焦点イメージングを含む下流分析を記述し、薬物を評価するために抗腫瘍治療薬としての候補者の可能性このプロトコルは、各患者および疾患の段階のための特定の薬物の同定と精密医学をサポートする。
Abstract
このプロトコルでは、生理的に代表的な微小環境における抗癌治療のハイスループットスクリーニングを可能にするために、384ウェルの吊り下げ液滴内で腫瘍スフェロイドを生成するための手順を概説する。患者由来のがん幹細胞スフェロイドの形成と、薬物治療後の徹底的な分析のためのこれらのスフェロイドの操作について概説する。具体的には、スフェロイド形態、増殖、生存率、薬物毒性、細胞表現型および細胞局在化データの収集について説明する。このプロトコルは、384ウェル吊り下げプラットフォームを使用して簡単に実装できる分析技術に重点を置き、高スループットの薬物スクリーニングに最適です。卵巣癌研究やがん幹細胞研究においてこのモデルの重要性を強調する一方で、384-wellプラットフォームは他のがんタイプや疾患モデルの研究に適しており、プラットフォームの有用性を多くの分野に広げています。生理学的に代表的な3D培養を容易に実施することで、個別化された薬物スクリーニングのスピードとスクリーニング結果の質を向上させることで、新しい治療薬や患者特異的な治療法の開発に役立てることを予測されます。治療戦略は、したがって、広範囲の臨床影響を持っています。
Introduction
世界のがん関連死亡率は、2018年1月に980万人の死者を出し、改善された治療法の開発の必要性を強調した。残念ながら、がん治療薬の開発コストは増加しており、1つの薬剤の開発コストは約6億5,000万米ドル2であり、新しい抗がん剤を開発するための改善戦略の必要性を示しています。癌幹細胞(CSC)は、化学抵抗力3の増加を特徴とし、自己更新能力、および新しい腫瘍4を播種する能力が腫瘍再発4、転移5、および及び化学耐性4、6は、すべてが腫瘍の悪性容量に寄与し、したがって高い死亡者数に寄与する。卵巣癌では、これらの細胞は腹腔内の悪性腹水液中に濃縮され、臨床的結果の悪さに関連する状態である1.CSCの悪性化により、従来の化学療法と組み合わせて使用する新しいCSCターゲティング薬の開発が進められている。CSCターゲティング薬の開発に伴ういくつかの課題があります:1)インビトロでのCSCの拡大と維持の難しさ。2)患者サンプルの不足;3)培養プラットフォームの生理学的関連性;4)患者間の薬物感受性における不均一性。このプロトコルは、これらの課題を克服できる高スループット 3D カルチャ プラットフォームの実装について概説します。特に、このシステムは、少数の患者由来卵巣CSCを用いて迅速な薬物スクリーニングを可能にし、下流分析技術に非常に適しています。卵巣癌やCSCの研究に最適ですが、当社のプラットフォームは、複雑な3D環境で他の癌や分化細胞タイプを研究する上でも価値があります。
複雑な3次元(3D)モデルは、癌細胞、非癌支持細胞、および細胞外マトリックス(ECM)タンパク質からなる3Dニッチである腫瘍微小環境(TME)の研究において重要である4。この3D環境は、インビトロ4の従来の2D細胞培養と比較して、独自の細胞形態、細胞細胞および細胞マトリックス相互作用、細胞分化、細胞移動、細胞密度、および拡散勾配をもたらす。これらの要因のすべては、3D培養内の差動薬物応答で終わり、薬剤耐性および生理学的関連性の増加を示す7,8.CSC分化および化学耐性における3D TMEの役割のために、生理学的微小環境におけるCSCターゲティング薬のスクリーニングが不可欠です。CSC薬物スクリーニングプラットフォームの生理学的関連性の向上は、患者特異的な薬物スクリーニング、薬剤開発、治療戦略の処方、および最終的には臨床結果を改善する可能性を有する。医薬品スクリーニングに使用されるプラットフォームは、有望な薬剤のコスト、時間、および臨床翻訳時間を最小限に抑えるために、高スループットとダウンストリーム分析方法と互換性があることが同様に重要です9.
現在、複雑なTMEは、マウス合成腫瘍モデル、細胞株由来異種移植片、および患者由来異種移植片(PDX)モデル12などの生体内モデルを通じて薬物スクリーニングアプリケーションに最適です。条件。しかし、これらのモデルの低スループットの性質は、ならびに、彼らが必要とするコスト、時間、および技術的なスキルセットは、迅速かつ高スループットの薬物スクリーニングアプリケーション13でその有用性を制限する。生体内モデルでこれらに代わるものとして、ヒドロゲル8を利用した多くのインビトロ3Dモデル、マイクロ流体デバイス内の培養器10、14、および非付着培養3、8また、コスト、時間、必要なスキルセットの面で参入障壁が低いため、開発されています。
ヒドロゲル培養プラットフォームは、マトリックス組成、機械的特性、およびマトリックス構造15に対して与えられる微細な制御において有利である。しかしながら、それらは高密度細胞培養14を阻害することができる。さらに、ヒドロゲルからの細胞の採取は、収穫方法15の潜在的に有害な影響のために、下流分析を複雑にしうる。一方、マイクロ流体デバイスは、試薬の消費量を最小限に抑え、反応時間を短縮し、廃棄物を最小限に抑えながら、同じデバイス内および細胞培養を生理学的に関連するスケールで出力検出を可能にするマイクロスケールデバイスです。急速な拡散14.これらの特性は、薬物毒性、有効性、および薬物動態学を調査するための有望なプラットフォームを作ります。しかし、効率的、定量化可能、再現性、およびユーザーフレンドリーな3D細胞培養の課題、ならびにかさばる高価なポンプシステムは、ハイスループット研究10におけるマイクロ流体アプリケーションを制限しています。また、効率的な検出設定と、分野を越えた実装が困難になる可能性もあり、マイクロ流体システム10の広範な採用を妨げている。
逆に、回転ミキサー(nutators)、超低アタッチメントプレート、および吊り下げ液滴の非付着状態で生成されたスフェロイドは、ユーザ定義のマトリックス成分を含まない。これらの方法論は、非付着性条件が精片腔内でスフェロイドが成長する条件の代表であるとして、卵巣癌の研究に特に関連する5.これらの非付着性培養法の中で、ヌタレータおよびぶら下げドロップスフェロイドは、超低アタッチメントプレートで生成されたスフェロイドと比較して、より高い圧縮、改造、および化学抵抗を示することが示されており、生理学的な増加を示唆している。関連性16,17,18,19.より小さい井戸サイズおよび最低の必要な細胞数からのハイスループットスクリーニングのための容量の増加のために、吊り下げドロッププレートの球体生成は薬物スクリーニングのための理想的なプラットホームである。ここでは、実装が容易で、下流分析に非常に適した384ウェルの吊り下げドロッププレートで、卵巣癌および卵巣CSCの高スループット薬物スクリーニングに最適な、384ウェルの吊り下げドロッププレートでの整合可能な3D生理学的プラットフォームを提示します。
当社の3D生理学的プラットフォームは、生理細胞接点、拡散勾配、細胞密度、および自然に産生されるECMタンパク質を含む3D培養のすべての利点を提供し、現実的な薬物応答に寄与する可能性がある16、 17,18,19.さらに、患者由来のCSCでこれらのスフェロイドを生成することにより、多くの技術的反復を同時に行う薬物1に対する患者特異的応答を決定し、患者腫瘍内で見られる可能性のある不均一性を克服することができる。サンプル20.さらに、3D培養はCSC集団3、16の維持を強化することが示されており、従って腹水7における濃縮CSC集団の代表である。これにより、生存率のフローサイトメトリー分析やCSCプロポーションを含む下流分析が容易になり、CSCターゲティング薬効効の最適な評価が可能になります。最後に、この生理学的プラットフォームは、実験中の複数の時点でのイメージング、細胞死と増殖の評価、免疫組織化学による細胞組織および形態、ELISAによる可溶性シグナル伝達と互換性があります。培地、フローサイトメトリーを有する細胞表現型、およびPCRに続く遺伝子発現。
Protocol
Representative Results
Discussion
3Dスフェロイド形成のための384ウェルの吊り下げドロッププレートプラットフォームは、あらゆる細胞生物学または癌生物学研究室に簡単に実装されたツールです。この生理学的なプラットホームは高いスループットの薬物スクリーニングを可能にする間生理学的に関連する3D培養内の細胞株および主要な患者のサンプルの研究を可能にする。また、このプラットフォームは、培養条件が高度…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究は、主にDOD OCRP早期キャリア研究者賞W81XWH-13-1-0134(GM)、DODパイロット賞W81XWH-16-1-0426(GM)、DOD研究者開始賞W81XWH-17-OCRP-IIRA(GM)、オバリアン癌とミシガン州のリブキンセンターによってサポートされています。同盟。この出版物で報告された研究は、賞番号P30CA046592の下で国立衛生研究所の国立がん研究所によってサポートされました。CMNは、国立科学財団大学院研究フェローシップ第1256260号の支援を受けています。MEBは、国家ニーズ分野(GAANN)フェローシップの教育省大学院支援によって支援されています。
Materials
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco | ILT25200056 | |
| 10 mL serological pipet | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| 10,000 cSt Si oil | Millipore Sigma | 63148-62-9 | Used to coat spheroid array mold to facilitate removal of tissue processing gels, like Histogel, from the mold. |
| 100 mm tissue culture dish | Thermo Scientific | 130182 | |
| 15 ml conical tube | Celltreat | FL4021 | |
| 1X DMEM for Serum Free Medium | Gibco | 11965-092 | |
| 1X F12 for Serum Free Medium | Gibco | 11765-054 | |
| 1X phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | ILT10010023 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher | D1306 | |
| 40 µm filter | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 6-well plate | Fisher Scientific | 353046 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies Inc. | 1449 | A gentle cell detachment enzyme composed of proteolytic and collagenolytic enzymes. |
| ACK Lysing Buffer | Thermo Scientific | A1049201 | |
| alamarBlue | Invitrogen | DAL1025 | Resazurin dye used to measure viability and proliferation of cells based on their ability to reduce resazurin to resorufin, which is highly fluorescent. |
| ALDEFLUOR assay kit | Stem Cell Tech | 1700 | Kit to identify stem and progenitor cells that express high levels of aldehyde dehydrogenase , an indicator of cancer stem cells. The kit is composed of ALDEFLUOR Reagent, DEAB, Hydrochloric Acid, Dimethylsulphoxide, and ALDEFLUOR Assay Buffer. |
| ALDEFLUOR Diethylaminobenzaldehyde (DEAB) | Stem Cell Tech | 1705 | Diethylaminobenzaldehyde (DEAB) is an inhibitor of ALDH isozymes, used to determine non-specific ALDH staining. |
| Andor iXon x3 CCD Camera | Oxford Instruments | – | |
| Antibiotics and Antimycotics | Gibco | 15240-062 | |
| APC-isotype IgG2b | Miltenyi biotec | 130-092-217 | Isotype control to quantify non-specific staining of IgG2b antibodies. |
| B27 Supplement | Gibco | 17504044 | |
| basic Fibroblast Growth Factor | Stem Cell Technologies | 78003.1 | |
| BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes | Fisher Scientific | 14-826-79 | |
| BioTek Synergy HT Microplate Reader | BioTek | 7091000 | |
| CD133-APC | Miltenyi biotec | 130-113-184 | Fluorescent antibody targeting CD133, a cancer stem cell marker. |
| cellSens Dimension Software | Olympus | ||
| Cisplatin | Sigma-Aldrich | P4394 | Platinum based chemotherapy agent that functions as an alkylating agent that disrupts DNA. |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| Epidermal Growth Factor | Gibco | PHG0311 | |
| EVOS XL Core Cell Imaging System | Life Technologies | AME3300 | |
| Fetal Bovine Serum – premium (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Ficoll 400 | Sigma-Aldrich | F4375 | |
| Hemacytometer | Hausser Scientific | 1490 | |
| Histogel | Thermo Scientific | HG-4000-012 | Tissue processing gel that can penetrate and hold the specimen within the gel while preventing discoloration around the specimen upon staining. |
| Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells | Lonza | PT-5006 | |
| Human Microvascular Endothelial Cells | Lonza | CC2543 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium Supplement | Gibco | 51500-056 | |
| Live/Dead viability kit | Invitrogen | L3224 | Kit for the fluorescence based detection of live (calcein-AM) and dead cells (Ethidium Homodimer-1). |
| MEM Non-essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | |
| MetaMorph 7.8 Software | Molecular Devices | – | |
| Olympus IX81 Inverted Confocal Microscope | Olympus | – | |
| Olympus IX83 Research Inverted Microscope | Olympus | ||
| Parafilm M | Thomas Scientific | 7315D35 | Thermoplastic polymer strips that serve to limit droplet evaporation in hanging drop plates while still allowing for gas exchange. |
| Perfecta 3D 384 Well Hanging Drop Plates | 3D Biomatrix | HDP1384-8 | Available through Sigma-Aldrich |
| phalloidin AlexaFluor488 | Invitrogen | A12379 | Phalloidin is a peptide to fluorescently label F-actin in fixed cells. |
| ProJet 3500 HD Max | 3D Systems | – | 3D printer |
| Sterile DI water | Fisher Scientific | 353046 | |
| Trypan Blue | Gibco | 15250061 | Azo dye used to differentiate between live and dead cells based on its ability to pass through the damaged membrane of dead cells, but not the intact membrane of live cells. |
| VisiJet M3 Crystal | 3D Systems | – | A biocompatible polymer material for 3D printing. |
| Yokogawa CSU-X1 Confocal Scanner Unit | Yokogawa | – |
References
- . . All cancers Source: Globocan. , (2018).
- Prasad, V., Mailankody, S. Research and Development Spending to Bring a Single Cancer Drug to Market and Revenues After Approval. JAMA Internal Medicine. 177, 1569-1575 (2017).
- Raghavan, S., et al. Personalized Medicine Based Approach to Model Patterns of Chemoresistance and Tumor Recurrence Using Ovarian Cancer Stem Cell Spheroids. Clinical Cancer Research. 23 (22), 6934-6945 (2017).
- Jordan, C. T., Guzman, M. L., Noble, M. Cancer Stem Cells. New England Journal of Medicine. 355, 1253-1261 (2006).
- Ishiguro, T., et al. Establishment and Characterization of an In Vitro Model of Ovarian Cancer Stem-like Cells with an Enhanced Proliferative Capacity. Recherche en cancérologie. 76, 150-160 (2016).
- Páez, D., et al. Cancer Dormancy: A Model of Early Dissemination and Late Cancer Recurrence. Clinical Cancer Research. 18, 645-653 (2012).
- Ahmed, N., Stenvers, K. L. Getting to Know Ovarian Cancer Ascites: Opportunities for Targeted Therapy-Based Translational Research. Frontiers in Oncology. 3, (2013).
- Pradhan, S., Clary, J. M., Seliktar, D., Lipke, E. A. A three-dimensional spheroidal cancer model based on PEG-fibrinogen hydrogel microspheres. Biomaterials. 115, 141-154 (2017).
- Varna, M., Bertheau, P., Legrès, L. Tumor Microenvironment in Human Tumor Xenografted Mouse Models. Journal of Analytical Oncology. 3, 159-166 (2014).
- Huang, S. B., et al. An integrated microfluidic cell culture system for high-throughput perfusion three-dimensional cell culture-based assays: Effect of cell culture model on the results of chemosensitivity assays. Lab on a Chip. 13, 1133-1143 (2013).
- Zang, R., Li, D., Tang, I. C., Wang, J., Yang, S. T. Cell-Based Assays in High-Throughput Screening for Drug Discovery. International Journal of Biotechnology for Wellness Industries. , (2012).
- Murphy, B., et al. Evaluation of alternative in vivo drug screening methodology: a single mouse analysis. Recherche en cancérologie. 76, 5798-5809 (2016).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived Xenograft models: An emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4, 998-1013 (2014).
- Damiati, S., Kompella, U. B., Damiati, S. A., Kodzius, R. Microfluidic devices for drug delivery systems and drug screening. Genes. 9, (2018).
- Caliari, S. R., Burdick, J. A. A Practical Guide to Hydrogels for Cell Culture. Nature Methods. 14, 69-81 (2016).
- Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy. Journal of Control Release. , (2012).
- Mehta, P., Novak, C., Raghavan, S., Ward, M., Mehta, G., Papaccio, G., Desiderio, V. Self-Renewal and CSCs In Vitro Enrichment: Growth as Floating Spheres. Cancer Stem Cells: Methods and Protocols. , 61-75 (2018).
- Raghavan, S., et al. Formation of stable small cell number three-dimensional ovarian cancer spheroids using hanging drop arrays for preclinical drug sensitivity assays. Gynecologic Oncology. 138, 181-189 (2015).
- Raghavan, S., et al. Comparative analysis of tumor spheroid generation techniques for differential in vitro drug toxicity. Oncotarget. 7, 16948-16961 (2016).
- Kim, S., et al. Evaluating Tumor Evolution via Genomic Profiling of Individual Tumor Spheroids in a Malignant Ascites. Scientific Reports. 8, 1-11 (2018).
- Silva, I. A., et al. Aldehyde dehydrogenase in combination with CD133 defines angiogenic ovarian cancer stem cells that portend poor patient survival. Recherche en cancérologie. 71, 3991-4001 (2011).
- Pulaski, H. L., et al. Identifying alemtuzumab as an anti-myeloid cell antiangiogenic therapy for the treatment of ovarian cancer. Journal of Translational Medicine. 7, 49 (2009).
- Jager, L. D., et al. Effect of enzymatic and mechanical methods of dissociation on neural progenitor cells derived from induced pluripotent stem cells. Advances in Medical Sciences. 61, 78-84 (2016).
- Ivanov, D. P., Grabowska, A. M. Spheroid arrays for high-throughput single-cell analysis of spatial patterns and biomarker expression in 3D. Scientific Reports. 7, 41160 (2017).
