암 줄기 세포를 표적으로 하는 반대로 신 생물 성 약 검열을 위한 생리학 환자 파생된 3D Spheroids
Summary
이 프로토콜은 약물 을 평가하기 위해 증식, 세포 독성 테스트, 유세포 분석, 면역 형광 염색 및 공초점 이미징의 정량화를 포함한 환자 유래 스페로이드 생성 및 하류 분석을 설명합니다. 반대로 신생물 치료제로 후보자의 잠재력. 이 프로토콜은 각 환자 및 질병 단계에 대한 특정 약물을 식별하여 정밀 의학을 지원합니다.
Abstract
이 프로토콜에서는 생리학적으로 대표적인 미세 환경에서 항암 치료제의 높은 처리량 스크리닝을 허용하기 위해 384 웰 매달려 있는 액적 내에서 종양 스페로이드 생성 절차를 설명합니다. 우리는 환자 유래 암 줄기 세포 스페로이드의 형성뿐만 아니라, 약물 치료 다음 철저한 분석을 위해 이러한 스페로이드의 조작을 설명합니다. 구체적으로, 우리는 스페로이드 형태, 증식, 생존력, 약물 독성, 세포 표현형 및 세포 국소화 데이터의 수집을 설명합니다. 이 프로토콜은 384웰 매달려 있는 드롭 플랫폼을 사용하여 쉽게 구현할 수 있는 분석 기술에 중점을 두어 처리량이 높은 약물 스크리닝에 이상적입니다. 우리는 난소암 연구와 암 줄기 세포 연구에서이 모델의 중요성을 강조하는 동안, 384 웰 플랫폼은 다른 암 유형 및 질병 모델의 연구에 적합, 많은 분야에 플랫폼의 유용성을 확장. 이 플랫폼은 쉽게 구현된 생리학적 대표 3D 배양을 통해 맞춤화된 약물 스크리닝의 속도와 스크리닝 결과의 품질을 개선함으로써 새로운 치료법 및 환자 별 개발에 도움이 될 것으로 예측됩니다. 치료 전략을 수립하여 광범위한 임상 적 영향을 미칩니다.
Introduction
전 세계적으로 암 관련 사망률은 2018년 980만 명에 이르렀으며, 개선된 치료법개발의 필요성을 강조하고 있다. 안타깝게도, 새로운 항암제 개발을 위한 개선된 전략의 필요성을 나타내는 약 6억 5천만 달러의 비용이 드는 단일 약물의 개발로 인해 암 치료제 개발 비용이 증가하고 있습니다. 암 줄기 세포 (CSC), 증가 화학 저항을 특징으로3,자기 갱신 하는 능력, 그리고 새로운 종양을 종자 하는 능력4 종양 재발에 대 한 책임 것으로 생각 된다4,전이5,및 화학 저항4,6, 이는 모두 종양의 악성 용량에 기여하므로 높은 사망자 수입니다. 난소암에서, 이 세포는 복강내의 악성 복수액에서 풍부하게 발견되며, 이는 나쁜 임상 결과와 관련된 상태이다1. CSC의 악성 기능의 결과로, 전통적인 화학요법과 함께 사용하기 위하여 새로운 CSC 표적으로 하는 약을 개발하는 추진이 있었습니다. 포함 하는 CSC 표적 약물의 개발에 수반 하는 몇 가지 도전이 있다: 1) 시험관에서 CSC를 확장 하 고 유지 에 어려움; 2) 환자 샘플의 부족; 3) 배양 플랫폼의 생리적 관련성; 4) 환자 들 간의 약물 감수성의 이질성. 이 프로토콜은 이러한 각 과제를 극복할 수 있는 높은 처리량의 3D 문화 플랫폼 구현에 대해 설명합니다. 특히, 이 시스템은 소수의 환자 유래 난소 CSC를 사용하여 신속한 약물 스크리닝을 허용하며, 다운스트림 분석 기술에 매우 적합합니다. 난소암과 CSC를 연구하는 데 이상적이지만, 당사의 플랫폼은 복잡한 3D 환경에서 다른 암 과 분화 세포 유형을 연구하는 데에도 유용합니다.
복합 3차원(3D) 모델은 암세포, 비암 지지 세포 및 세포외 매트릭스(ECM) 단백질로 구성된 3D 틈새 시장인 종양 미세환경(TME) 단백질을 연구하는 데 매우 중요합니다. 이러한 3D 환경은 시험관내 전통적인 2D 세포 배양에 비해 독특한 세포 형태, 세포 세포 및 세포 매트릭스 상호작용, 세포분화, 세포 이동, 세포 밀도 및 확산 구배를 초래한다 4. 이러한 모든 요인은 3D 배양 내의 차동 약물 반응에서 절정을이며, 약물 내성 및 생리적 관련성증가를 나타내며 7,8. CSC 분화 및 화학 저항성에서 3D TME의 역할로 인해 생리학적 미세 환경에서 약물을 대상으로 하는 CSC를 선별하는 것이 중요합니다. CSC 약물 스크리닝 플랫폼의 생리학적 관련성을 개선하는 것은 환자 특정 약물 스크리닝, 약물 개발, 치료 전략의 제형 및 궁극적으로 임상 결과를 개선할 수 있는 잠재력을 가지고 있다. 약물 스크리닝에 사용되는 플랫폼이 높은 처리량과 다운스트림 분석 방법과 호환되어 유망한 약물의 비용, 시간및 임상 번역 시간을 최소화하는 것이 똑같이 중요합니다 9.
현재, 복합TME는 생리학적을 제공하기 때문에 뮤린 합성 종양 모델, 세포주 유래 이종이식 및 환자 유래 이종이식(PDX) 모델(12)과같은 생체 내 모델을 통한 약물 스크리닝 적용을 가장 잘 유지한다. 조건. 그러나, 이러한 모델들의 낮은 처리량 특성은 비용, 시간 및 기술적 기술 세트뿐만 아니라 신속하고 높은 처리량약물 스크리닝 애플리케이션에서 그들의 유용성을 제한한다. 이러한 생체내 모델에 대한 대안으로, 하이드로겔8,미세유체 장치 내 배양 또는 ‘오르간 온 칩’ 장치10,14,및 비부착 배양3,8을 이용한 많은 시험관내 3D 모델 비용, 시간 및 필요한 기술 집합 측면에서 진입 장벽이 낮기 때문에 개발되었습니다.
하이드로겔 배양 플랫폼은 매트릭스 조성물, 기계적 특성 및 매트릭스구조(15)에걸쳐 제공되는 미세 제어에 유리하다; 그러나, 그들은 고밀도 세포 배양(14)을억제 할 수 있습니다. 또한, 하이드로겔로부터 의한 수확 세포는 수확 방법15의잠재적으로 유해한 영향으로 인해 하류 분석을 복잡하게 할 수 있다. 반면, 미세유체 장치는 동일한 장치 내에서 출력 검출을 허용하고, 시약의 소비를 최소화하고, 반응 시간을 줄이며, 폐기물을 최소화하며, 생리학적으로 관련된 스케일에서 세포 배양을 가능하게 하는 마이크로스케일 장치이며, 급속 한 확산14. 이러한 특성으로 인해 약물 독성, 효능 및 약물 동태학을 조사하기 위한 유망한 플랫폼이 됩니다. 그러나 효율적이고 정량화 가능하며 재현 가능하며 사용자 친화적인 3D 세포 배양뿐만 아니라 부피가 크고 비용이 많이 드는 펌핑 시스템의 과제는 고처리량 연구에서 미세 유체 응용을 제한했습니다10. 효율적인 검출 설정및 필드 전반에 걸친 잠재적으로 어려운 구현은 또한 미세 유체 시스템10의광범위한 채택을 방해했다.
반대로 회전 믹서(nutators), 초저 부착 플레이트 및 매달려 있는 물방울에서 비부착 조건에서 생성된 스페로이드는 사용자 정의 매트릭스 성분을 포함하지 않습니다. 이러한 방법론은 특히 비 부착 조건이 스페로이드가 복강 내에서 성장하는 조건을 대표하기 때문에 난소암을 연구하는 데 특히 관련이있습니다5. 이러한 비 부착 배양 방법 내에서, 영양기와 매달려 드롭 스페로이드는 초저 부착 플레이트에서 생성 된 스페로이드에 비해 더 높은 압축, 리모델링 및 화학 저항을 나타내는 것으로 나타났습니다, 증가 생리학적 제안 관련성16,17,18,19. 더 작은 우물 크기와 최소한의 필요한 셀 번호에서 높은 처리량 스크리닝을 위한 증가된 용량으로 인해, 매달려 있는 드롭 플레이트의 스페로이드 생성은 약물 스크리닝을 위한 이상적인 플랫폼입니다. 여기에서, 우리는 384 잘 매달려 있는 낙하 판에 있는 조정 가능한 3D 생리학 플랫폼을 제시합니다, 그 구현하기 쉽고 다운스트림 분석에 높게 순종합니다, 난소암과 난소 CSCs의 높은 처리량 약 검열을 위해 이상적 만들기.
우리의 3D 생리학적 플랫폼은 생리적 세포-세포 접촉, 확산 구배, 세포 밀도 및 자연적으로 생성된 ECM 단백질을 포함하여 3D 배양의 모든 장점을 제공하며, 이는 현실적인 약물 반응에 기여할 수 있습니다16, 17,18,19. 추가적으로, 환자 파생된 CSCs를 가진 이 스페로이드를 생성해서, 우리는 많은 기술적인 복제를 동시에 가진 약1에 환자 특정 반응을 결정할 수 있습니다, 참을성 있는 종양 내의 찾아질 수 있는 이질성을 극복하기 위하여 샘플20. 더욱이, 3D 문화는 CSC 인구3,16의 유지관리를 향상시키는 것으로 나타났으며, 따라서 7의 풍부한 CSC 인구를 대표한다. 이는 생존 가능성 및 CSC 비율의 유세포 분석 분석을 포함한 쉬운 다운스트림 분석과 결합되어 CSC 표적화 약물 효능을 최적으로 평가할 수 있습니다. 마지막으로, 이 생리학적 플랫폼은 실험 중 여러 시점의 이미징과 호환되며, 세포 사멸 및 증식 평가, 면역조직화학을 위한 세포 조직 및 형태학, 조건부 ELISA를 위한 수용성 신호 중간, 유세포 분석및 PCR 에 따른 유전자 발현을 가진 세포 표현형.
Protocol
Representative Results
Discussion
3D 스페로이드 형성을 위한 384웰 매달려 있는 드롭 플레이트 플랫폼은 모든 세포 생물학 또는 암 생물학 실험실을 위한 쉽게 구현되는 도구입니다. 이 생리학적 플랫폼은 높은 처리량 약물 스크리닝을 허용하면서 생리학적으로 관련된 3D 배양 내에서 세포주뿐만 아니라 1차 환자 샘플을 연구할 수 있게 합니다. 또한 이 플랫폼은 배양 조건이 고도로 조정가능하도록 하여 도금 밀도, 세포 공동 배양 …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 주로 DOD OCRP 초기 경력 조사자 상 W81XWH-13-1-0134 (GM), DOD 파일럿 상 W81XWH-16-1-0426 (GM), DOD 조사자 시작 상 W81XWH-17-OCRP-IIRA (GM), 난소 암및 미시간 난소 암에 대한 리브킨 센터에 의해 지원됩니다 얼라이언스. 이 간행물에 보고된 연구는 수상 번호 P30CA046592의 밑에 건강의 국가 학회의 국립 암 학회에 의해 지원되었습니다. CMN은 그랜트 번호 1256260에서 국립 과학 재단 대학원 연구 펠로우십에 의해 지원됩니다. MEB는 국가 필요 지역 (GAANN) 펠로우십에서 교육부 대학원 지원에 의해 지원됩니다.
Materials
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco | ILT25200056 | |
| 10 mL serological pipet | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| 10,000 cSt Si oil | Millipore Sigma | 63148-62-9 | Used to coat spheroid array mold to facilitate removal of tissue processing gels, like Histogel, from the mold. |
| 100 mm tissue culture dish | Thermo Scientific | 130182 | |
| 15 ml conical tube | Celltreat | FL4021 | |
| 1X DMEM for Serum Free Medium | Gibco | 11965-092 | |
| 1X F12 for Serum Free Medium | Gibco | 11765-054 | |
| 1X phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | ILT10010023 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher | D1306 | |
| 40 µm filter | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 6-well plate | Fisher Scientific | 353046 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies Inc. | 1449 | A gentle cell detachment enzyme composed of proteolytic and collagenolytic enzymes. |
| ACK Lysing Buffer | Thermo Scientific | A1049201 | |
| alamarBlue | Invitrogen | DAL1025 | Resazurin dye used to measure viability and proliferation of cells based on their ability to reduce resazurin to resorufin, which is highly fluorescent. |
| ALDEFLUOR assay kit | Stem Cell Tech | 1700 | Kit to identify stem and progenitor cells that express high levels of aldehyde dehydrogenase , an indicator of cancer stem cells. The kit is composed of ALDEFLUOR Reagent, DEAB, Hydrochloric Acid, Dimethylsulphoxide, and ALDEFLUOR Assay Buffer. |
| ALDEFLUOR Diethylaminobenzaldehyde (DEAB) | Stem Cell Tech | 1705 | Diethylaminobenzaldehyde (DEAB) is an inhibitor of ALDH isozymes, used to determine non-specific ALDH staining. |
| Andor iXon x3 CCD Camera | Oxford Instruments | – | |
| Antibiotics and Antimycotics | Gibco | 15240-062 | |
| APC-isotype IgG2b | Miltenyi biotec | 130-092-217 | Isotype control to quantify non-specific staining of IgG2b antibodies. |
| B27 Supplement | Gibco | 17504044 | |
| basic Fibroblast Growth Factor | Stem Cell Technologies | 78003.1 | |
| BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes | Fisher Scientific | 14-826-79 | |
| BioTek Synergy HT Microplate Reader | BioTek | 7091000 | |
| CD133-APC | Miltenyi biotec | 130-113-184 | Fluorescent antibody targeting CD133, a cancer stem cell marker. |
| cellSens Dimension Software | Olympus | ||
| Cisplatin | Sigma-Aldrich | P4394 | Platinum based chemotherapy agent that functions as an alkylating agent that disrupts DNA. |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| Epidermal Growth Factor | Gibco | PHG0311 | |
| EVOS XL Core Cell Imaging System | Life Technologies | AME3300 | |
| Fetal Bovine Serum – premium (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Ficoll 400 | Sigma-Aldrich | F4375 | |
| Hemacytometer | Hausser Scientific | 1490 | |
| Histogel | Thermo Scientific | HG-4000-012 | Tissue processing gel that can penetrate and hold the specimen within the gel while preventing discoloration around the specimen upon staining. |
| Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells | Lonza | PT-5006 | |
| Human Microvascular Endothelial Cells | Lonza | CC2543 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium Supplement | Gibco | 51500-056 | |
| Live/Dead viability kit | Invitrogen | L3224 | Kit for the fluorescence based detection of live (calcein-AM) and dead cells (Ethidium Homodimer-1). |
| MEM Non-essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | |
| MetaMorph 7.8 Software | Molecular Devices | – | |
| Olympus IX81 Inverted Confocal Microscope | Olympus | – | |
| Olympus IX83 Research Inverted Microscope | Olympus | ||
| Parafilm M | Thomas Scientific | 7315D35 | Thermoplastic polymer strips that serve to limit droplet evaporation in hanging drop plates while still allowing for gas exchange. |
| Perfecta 3D 384 Well Hanging Drop Plates | 3D Biomatrix | HDP1384-8 | Available through Sigma-Aldrich |
| phalloidin AlexaFluor488 | Invitrogen | A12379 | Phalloidin is a peptide to fluorescently label F-actin in fixed cells. |
| ProJet 3500 HD Max | 3D Systems | – | 3D printer |
| Sterile DI water | Fisher Scientific | 353046 | |
| Trypan Blue | Gibco | 15250061 | Azo dye used to differentiate between live and dead cells based on its ability to pass through the damaged membrane of dead cells, but not the intact membrane of live cells. |
| VisiJet M3 Crystal | 3D Systems | – | A biocompatible polymer material for 3D printing. |
| Yokogawa CSU-X1 Confocal Scanner Unit | Yokogawa | – |
References
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