Fysiologiske pasient avledet 3D Spheroids for anti-neoplastic Drug screening å målrette Cancer stamceller

Summary

Denne protokollen beskriver generering av pasient-avledet spheroids, og nedstrøms analyse inkludert kvantifisering av spredning, cytotoksisitet testing, flyt flowcytometri, immunofluorescence farging og konfokalmikroskopi bildebehandling, for å vurdere narkotika potensielle neoplastic legemidler. Denne protokollen støtter presisjons medisin med identifisering av spesifikke medikamenter for hver pasient og stadium av sykdom.

Abstract

I denne protokollen, vi skissere fremgangsmåten for generering av tumor spheroids innen 384-vel hengende dråper for å muliggjøre høy gjennomstrømming screening av anti-kreft legemiddel selskap i en fysiologisk representant mikromiljøet. Vi skisserer dannelsen av pasienten avledet kreft stilk cellen spheroids, samt manipulering av disse spheroids for grundige analyser etter behandling. Nærmere bestemt beskriver vi innsamling av spheroid morfologi, spredning, levedyktighet, legemiddel toksisitet, celle fenotype og celle lokaliseringsdata. Denne protokollen fokuserer tungt på analyse teknikker som er lett implementeres ved hjelp av 384-godt hengende slipp plattform, noe som gjør den ideell for høy gjennomstrømming narkotika screening. Mens vi understreke viktigheten av denne modellen i eggstokkene kreft studier og kreft stilk cellen forskning, er 384-brønn plattform mottagelig for forskning av andre krefttyper og sykdom modeller, utvide nytten av plattformen til mange felt. Ved å forbedre hastigheten på personlig narkotika screening og kvaliteten på screening resultater gjennom enkelt implementert fysiologisk representative 3D-kulturer, er denne plattformen spådd til hjelp i utviklingen av nye legemiddel-og pasientspesifikke behandlings strategier, og dermed ha vidtrekkende klinisk effekt.

Introduction

Verdensomspennende kreft-relatert dødelighet nådde en toll på 9 800 000 dødsfall i 2018¹, fremhever behovet for utvikling av forbedrede legemiddel selskap. Dessverre, er kostnaden for å utvikle kreft narkotika økende, med utviklingen av et enkelt stoff koster ca 650 000 000 USD² indikerer behovet for forbedrede strategier for å utvikle nye anti-kreft narkotika. Kreft stamceller (CSCs), som er preget av økt chemoresistance³, evne til å fornye seg selv, og evnen til å frø nye svulster⁴ antas å være ansvarlig for tumor gjentakelse⁴, metastasering⁵, og chemoresistance^4,6, som alle bidrar til ondartet kapasitet av svulsten og dermed høye dødstallene. I kreft i eggstokkene finnes disse cellene beriket i den ondartede ascites væsken i bukhulen, en tilstand knyttet til dårlige kliniske utfall¹. Som et resultat av den ondartede evnene til CSCs, har det vært et push å utvikle nye CSC målretting narkotika å bruke i forbindelse med tradisjonelle chemotherapies. Det er flere utfordringer som følger utviklingen av CSC målretting narkotika inkludert: 1) vanskeligheter med å utvide og vedlikeholde CSCs in vitro; 2) knapphet på pasientprøver; 3) fysiologisk relevans av kulturen plattformen; og 4) heterogenitet i legemiddel følsom het mellom pasientene. Denne protokollen skisserer implementeringen av en 3D kultur plattform med høy gjennomstrømming som kan overvinne hver av disse utfordringene. Spesielt gir dette systemet for rask narkotika screening ved hjelp av et lite antall pasient-avledet eggstokkene CSCs, og er svært mottagelig for nedstrøms analyse teknikker. Selv om det er ideelt for å studere kreft i eggstokkene og CSCs, er plattformen også verdifull når det gjelder å studere andre typer kreft og forskjellige celler i komplekse 3D-miljøer.

Komplekse 3-dimensjonale (3D) modeller er avgjørende i å studere tumor mikromiljøet (TME), som er en 3D nisje bestående av kreftceller, ikke-kreft støtte celler, og ekstracellulære matrise (ECM) proteiner⁴. Denne 3D-miljø resulterer i unike celle morfologi, celle-celle og celle-matrise interaksjoner, celle differensiering, celle migrasjon, celle tetthet, og diffusjon graderinger sammenlignet med tradisjonelle 2D cellekultur in vitro⁴. Alle disse faktorene kulminere i differensial narkotika respons i 3D-kulturer, viser økt resistens og fysiologiske relevans^7,8. På grunn av rollen til 3D TME i CSC differensiering og chemoresistance, er det viktig å skjermen for CSC målretting narkotika i fysiologiske microenvironments. Forbedre fysiologiske relevansen av CSC narkotika screening plattformer har potensial til å forbedre pasientens spesifikke narkotika screening, narkotika utvikling, formulering av behandlings strategier, og til slutt kliniske utfall. Det er like viktig at plattformen som brukes for narkotika screening være høy gjennomstrømming og kompatibel med nedstrøms analysemetoder for å minimere kostnader, tid og klinisk oversettelse tid lovende narkotika⁹.

Foreløpig er det komplekse TME best vedlikeholdt for narkotika screening applikasjoner gjennom in vivo modeller som murine syngeneic tumor modeller, cellelinje-avledet xenotransplantater, og pasient-avledet xenograft (PDX) modeller¹², som de gir fysiologiske Forhold. Men den lave gjennomstrømningen natur disse modellene, samt, kostnaden, tid og tekniske ferdigheter som de krever begrenser deres nytte i rask, høy gjennomstrømming narkotika screening programmer¹³. Som alternativ til disse in vivo-modellene har mange in vitro 3D-modeller som bruker hydrogeler⁸, kultur innen mikrovæskebasert enheter eller ‘ organ-on-a-chip ‘-enheter^10,14, og ikke-tilhenger kulturer^3,8 har også blitt utviklet, på grunn av deres lave barriere til oppføring i form av kostnader, tid og nødvendige skillset.

Hydrogel kultur plattformer er fordelaktig i fin kontroll by over matrisen sammensetning, mekaniske egenskaper, og matrise struktur¹⁵; men de kan hemme høy tetthet cellekultur¹⁴. I tillegg kan høsting celler fra hydrogeler komplisere nedstrøms analyse, på grunn av potensielt skadelige effekter av høsting metoder¹⁵. Mikrovæskebasert enheter, derimot, er Mikroskala enheter som tillater for utdata deteksjon innenfor samme enhet og for cellekultur på fysiologisk relevante skalaer med minimalt forbruk av reagenser, redusert reaksjonstid, minimert avfall, og rask diffusjon¹⁴. Disse egenskapene gjør dem lovende plattformer for å undersøke medikament toksisitet, effekt og farmakokinetikken. Utfordringene med effektiv, målbar, reproduserbar og brukervennlig 3D cellekultur, samt, store og kostbare pumpesystemer har begrenset mikrovæskebasert applikasjoner i høy gjennomstrømming forskning¹⁰. Effektiv deteksjon oppsett og potensielt vanskelig implementering på tvers av felt har også hindret utbredt adopsjon av mikrovæskebasert systemer¹⁰.

Contrarily, spheroids generert i ikke-tilhenger forhold i roterende miksere (nutators), ultra-lav festeplater, og hengende dråper inkluderer ikke brukerdefinerte matrise-komponenter. Disse metodene er spesielt relevant for å studere eggstokkene kreft som ikke-tilhenger forholdene er representative for forholdene der spheroids vokser i bukhulen⁵. Innenfor disse ikke-tilhenger kultur metoder, nutator og hengende drop spheroids har vist å vise høyere komprimering, remodeling, og chemoresistance sammenlignet med spheroids generert i Ultra-Low vedlegg plater, noe som tyder på økt fysiologiske relevans^16,17,18,19. På grunn av økt kapasitet for screening med høy gjennomstrømming fra mindre brønn størrelser og minimalt nødvendige celle tall, er spheroid generasjon i hengende dråpe plater en ideell plattform for narkotika screening. Her presenterer vi en tunable 3D fysiologiske plattform i 384-vel hengende drop plater, som er lett å implementere og svært mottagelig for nedstrøms analyse, noe som gjør den ideell for høy gjennomstrømning narkotika screening av eggstokkene kreft og eggstokkene CSCs.

Vår 3D fysiologiske-plattform gir alle fordelene med 3D-kultur, inkludert fysiologiske celle kontakter, diffusjon graderinger, celle tetthet og naturlig produserte ECM-proteiner, som kan bidra til realistiske narkotika responser^{16, 17,18,19}. I tillegg, ved å generere disse spheroids med pasient-avledet CSCs, er vi i stand til å bestemme pasientens konkrete tiltak mot narkotika¹ med mange tekniske replikerer samtidig, for å overvinne heterogenitet som kan finnes i pasientens svulst prøvene²⁰. Videre har 3D-kultur vist å øke vedlikeholdet av CSC populasjoner^3,16 og dermed er representativt for beriket CSC populasjoner i ascites⁷. Dette kombinert med enkel nedstrøms analyse, inkludert flyt flowcytometri analyse av levedyktighet og CSC proporsjoner gir optimal evaluering av CSC målretting narkotika effekt. Til slutt, denne fysiologiske plattform er forenlig med tenkelig for mangfoldig tid meningene under eksperiment, bedømmelse av cellen død og spredning, cellen organisasjon og morfologi med immunhistokjemi, løselig signal med ELISA opp på betinget medium, celle fenotyper med Flow flowcytometri, og genuttrykk etter PCR.

Protocol

Alle pasientprøver er samlet under en godkjent IRB protokoll fra samtykkende pasienter, hvis prøvene er de-identifisert etter tumor “debulking” og ascites samling. 1. generering av Spheroids fra små celle tall i 384-brønn hengende drop plater Plasser den hengende dråpe platen i en sonicator fylt med sterilt deionisert (DI) vann og sonikere i 20 min. Med en hansker hånd fjerner du platen fra sonicator og vasker den med rennende DI vann. La platen til å sitte…

Representative Results

Spheroids dannet med cellelinjer eller pasient-avledet CSCs kan dannes med en rekke små celle tall innenfor hengende dråper (figur 2a). Spheroids skjema pålitelig med så få som 10 celler per brønn, noe som gir mulighet for bevaring av sjeldne pasientprøver. Celler innenfor disse spheroids er omgitt av andre celler i 3 dimensjoner som de ville være i Vivo, slik at for fysiologiske celle-celle-kontakter og diffusjon priser. Tumor celler i spheroids sprer seg forårsaker at spheroids ut…

Discussion

Den 384-godt hengende drop plate plattform for 3D spheroid formasjon er en lett implementert verktøy for enhver cellebiologi eller kreft biologi laboratorier. Denne fysiologiske plattformen gjør det mulig å studere cellelinjer, i tillegg til primær pasientprøver innen fysiologisk relevante 3D-kulturer, samtidig som det gir høy gjennomstrømming for narkotika screening. Plattformen sikrer også at kultur forholdene er svært tunable, noe som gir tett kontroll over plating tetthet, celle co-kultur prosenter, ekstrace…

Materials

0.25% trypsin-EDTA	Gibco	ILT25200056
10 mL serological pipet	Fisher Scientific	13-678-11E
10,000 cSt Si oil	Millipore Sigma	63148-62-9	Used to coat spheroid array mold to facilitate removal of tissue processing gels, like Histogel, from the mold.
100 mm tissue culture dish	Thermo Scientific	130182
15 ml conical tube	Celltreat	FL4021
1X DMEM for Serum Free Medium	Gibco	11965-092
1X F12 for Serum Free Medium	Gibco	11765-054
1X phosphate buffered saline (PBS)	Gibco	ILT10010023
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Thermo Fisher	D1306
40 µm filter	Fisher Scientific	22363547
6-well plate	Fisher Scientific	353046
Accutase	Innovative Cell Technologies Inc.	1449	A gentle cell detachment enzyme composed of proteolytic and collagenolytic enzymes.
ACK Lysing Buffer	Thermo Scientific	A1049201
alamarBlue	Invitrogen	DAL1025	Resazurin dye used to measure viability and proliferation of cells based on their ability to reduce resazurin to resorufin, which is highly fluorescent.
ALDEFLUOR assay kit	Stem Cell Tech	1700	Kit to identify stem and progenitor cells that express high levels of aldehyde dehydrogenase , an indicator of cancer stem cells. The kit is composed of ALDEFLUOR Reagent, DEAB, Hydrochloric Acid, Dimethylsulphoxide, and ALDEFLUOR Assay Buffer.
ALDEFLUOR Diethylaminobenzaldehyde (DEAB)	Stem Cell Tech	1705	Diethylaminobenzaldehyde (DEAB) is an inhibitor of ALDH isozymes, used to determine non-specific ALDH staining.
Andor iXon x3 CCD Camera	Oxford Instruments	–
Antibiotics and Antimycotics	Gibco	15240-062
APC-isotype IgG2b	Miltenyi biotec	130-092-217	Isotype control to quantify non-specific staining of IgG2b antibodies.
B27 Supplement	Gibco	17504044
basic Fibroblast Growth Factor	Stem Cell Technologies	78003.1
BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes	Fisher Scientific	14-826-79
BioTek Synergy HT Microplate Reader	BioTek	7091000
CD133-APC	Miltenyi biotec	130-113-184	Fluorescent antibody targeting CD133, a cancer stem cell marker.
cellSens Dimension Software	Olympus
Cisplatin	Sigma-Aldrich	P4394	Platinum based chemotherapy agent that functions as an alkylating agent that disrupts DNA.
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Invitrogen	D1306
Epidermal Growth Factor	Gibco	PHG0311
EVOS XL Core Cell Imaging System	Life Technologies	AME3300
Fetal Bovine Serum – premium (FBS)	Atlanta Biologicals	S11150
Ficoll 400	Sigma-Aldrich	F4375
Hemacytometer	Hausser Scientific	1490
Histogel	Thermo Scientific	HG-4000-012	Tissue processing gel that can penetrate and hold the specimen within the gel while preventing discoloration around the specimen upon staining.
Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells	Lonza	PT-5006
Human Microvascular Endothelial Cells	Lonza	CC2543
Insulin-Transferrin-Selenium Supplement	Gibco	51500-056
Live/Dead viability kit	Invitrogen	L3224	Kit for the fluorescence based detection of live (calcein-AM) and dead cells (Ethidium Homodimer-1).
MEM Non-essential Amino Acids	Gibco	11140-050
MetaMorph 7.8 Software	Molecular Devices	–
Olympus IX81 Inverted Confocal Microscope	Olympus	–
Olympus IX83 Research Inverted Microscope	Olympus
Parafilm M	Thomas Scientific	7315D35	Thermoplastic polymer strips that serve to limit droplet evaporation in hanging drop plates while still allowing for gas exchange.
Perfecta 3D 384 Well Hanging Drop Plates	3D Biomatrix	HDP1384-8	Available through Sigma-Aldrich
phalloidin AlexaFluor488	Invitrogen	A12379	Phalloidin is a peptide to fluorescently label F-actin in fixed cells.
ProJet 3500 HD Max	3D Systems	–	3D printer
Sterile DI water	Fisher Scientific	353046
Trypan Blue	Gibco	15250061	Azo dye used to differentiate between live and dead cells based on its ability to pass through the damaged membrane of dead cells, but not the intact membrane of live cells.
VisiJet M3 Crystal	3D Systems	–	A biocompatible polymer material for 3D printing.
Yokogawa CSU-X1 Confocal Scanner Unit	Yokogawa	–