Spheroids 3D derivados do paciente fisiológico para a seleção antineoplástica da droga para alvejar pilhas de haste do cancro

Summary

Este protocolo descreve a geração de spheroids paciente-derivados, e a análise a jusante que inclui a quantificação da proliferação, do teste da citotoxicidade, da citometria do fluxo, da coloração da imunofluorescência e da imagem latente confocal, a fim avaliar a medicina potencial dos candidatos como terapêutica antineoplásica. Este protocolo suporta a medicina da precisão com identificação de drogas específicas para cada paciente e estágio da doença.

Abstract

Neste protocolo, nós esboçamos o procedimento para a geração de esferoides do tumor dentro das gotas de suspensão 384-well para permitir a seleção da elevado-produção de terapêutica anti-câncer em um microambiente fisiologicamente representativo. Nós esboçamos a formação de esferoides derivados pacientes da pilha de haste do cancro, assim como, a manipulação destes esferoides para a análise completa depois do tratamento da droga. Especificamente, nós descrevemos a coleção da morfologia do esferóide, da proliferação, da viabilidade, da toxicidade da droga, do phenotype da pilha e dos dados da localização da pilha. Este protocolo centra-se fortemente em técnicas de análise que são facilmente implementadas usando o 384-bem pendurado drop plataforma, tornando-o ideal para a triagem de drogas de alta taxa de transferência. Enquanto enfatizamos a importância deste modelo em estudos de câncer de ovário e pesquisa de células-tronco de câncer, a plataforma 384-well é capaz de pesquisa de outros tipos de câncer e modelos de doenças, estendendo a utilidade da plataforma para muitos campos. Ao melhorar a velocidade de triagem de drogas personalizado e a qualidade dos resultados de triagem através de facilmente implementado fisiologicamente representativas culturas 3D, esta plataforma está prevista para ajudar no desenvolvimento de novas terapêuticas e pacientes específicos estratégias de tratamento e, portanto, têm um impacto clínico de grande alcance.

Introduction

A mortalidade mundial relacionada ao câncer atingiu um pedágio de 9,8 milhões mortes em 2018¹, destacando a necessidade de desenvolvimento de terapêutica melhorada. Infelizmente, o custo do desenvolvimento de drogas cancerosas está aumentando, com o desenvolvimento de uma única droga custando aproximadamente 650 milhões USD² indicando a necessidade de estratégias melhoradas para desenvolver novos medicamentos anticancerígenos. Células-tronco cancerosas (CSCs), que são caracterizadas por aumento da quimiorresistência³, a capacidade de autorenovar, e a capacidade de semente de novos tumores⁴ são pensados para ser responsável pelo recidiva tumoral⁴, metástase⁵, e quimiorresistência^4,6, que todos contribuem à capacidade maligno do tumor e assim ao pedágio elevado da morte. No cancro ovariano, estas pilhas são encontradas enriquecidas no líquido maligno das ascite na cavidade peritoneaa, uma circunstância associada com os resultados clínicos pobres¹. Em conseqüência das capacidades malignos de CSCs, houve um impulso para desenvolver o CSC novo que alvejam drogas para usar-se conjuntamente com quimioterapias tradicionais. Existem vários desafios que acompanham o desenvolvimento da CSC visando drogas, incluindo: 1) dificuldade em expandir e manter CSCs in vitro; 2) escassez de amostras de pacientes; 3) relevância fisiológica da plataforma de cultura; e 4) heterogeneidade na sensibilidade medicamentosa entre os pacientes. Este protocolo descreve a implementação de uma plataforma de cultura 3D de alta taxa de transferência que pode superar cada um desses desafios. Em particular, este sistema permite a triagem rápida de drogas usando pequenos números de CSCs ovarianos derivados do paciente, e é altamente capaz de técnicas de análise a jusante. Embora seja ideal para estudar câncer de ovário e CSCs, nossa plataforma também é valiosa no estudo de outros cânceres e tipos de células diferenciadas em ambientes 3D complexos.

Os modelos 3-dimensionais complexos (3D) são críticos em estudar o microambiente do tumor (TME), que é um Niche 3D compo de pilhas de cancro, de pilhas suportando do não-cancro, e de proteínas extracelular da matriz (ECM)⁴. Este ambiente 3D resulta em morfologia celular única, interações célula-célula e matriz celular, diferenciação celular, migração celular, densidade celular e gradientes de difusão em comparação com a cultura de células 2D tradicional in vitro⁴. Todos estes fatores culminam na resposta diferencial da droga dentro das culturas 3D, exibindo a resistência aumentada da droga e a relevância physiological^7,8. Devido ao papel do TME 3D na diferenciação e na quimiorresistência do CSC, é vital para a tela para o CSC que alvejam drogas em microambientes fisiológicos. Melhorar a relevância fisiológica de plataformas de triagem de drogas CSC tem o potencial para melhorar a triagem de drogas específicas do paciente, desenvolvimento de medicamentos, formulação de estratégias de tratamento e, finalmente, resultados clínicos. É igualmente importante que a plataforma utilizada para a triagem de fármacos seja de alto débito e compatível com métodos de análise a jusante para minimizar o tempo de custo, tempo e tradução clínica de drogas promissoras⁹.

Atualmente, o complexo TME é melhor mantido para aplicações de triagem de fármacos através de modelos in vivo, como modelos de tumor singeneico murino, xenoenxertos derivados de linhagem celular e Xenoenxerto derivado do paciente (PDX) modelos¹², pois fornecem Condições. No entanto, a natureza de baixa taxa de transferência desses modelos, bem como, o custo, o tempo e os conjuntos de habilidades técnicas que eles exigem limitam sua utilidade em aplicações de triagem de drogas rápidas e de alta taxa de transferência¹³. Como alternativas a estes modelos in vivo, muitos modelos in vitro 3D que utilizam hidrogéis⁸, cultura dentro de dispositivos microfluídico ou ‘ órgão-em-um-chip ‘ dispositivos^10,14, e culturas não aderentes^3,8 também foram desenvolvidas, devido à sua baixa barreira à entrada em termos de custo, tempo e skillset exigido.

As plataformas da cultura do Hydrogel são vantajosas no controle fino proporcionado sobre a composição da matriz, as propriedades mecânicas, e a estrutura da matriz¹⁵; no entanto, eles podem inibir a cultura de células de alta densidade¹⁴. Adicionalmente, a colheita de células de hidrogéis pode complicar a análise a jusante, devido a efeitos potencialmente nocivos dos métodos de colheita¹⁵. Os dispositivos microfluílicos, por outro lado, são dispositivos de microescala que permitem a detecção de saída dentro do mesmo dispositivo e para a cultura celular em escalas fisiologicamente relevantes com consumo mínimo de reagentes, tempo de reação diminuído, desperdício minimizado e difusão rápida¹⁴. Estas características tornam-nas plataformas promissoras para investigar a toxicidade, eficácia e farmacocinética da droga. No entanto, os desafios de uma cultura de células 3D eficiente, quantificável, reprodutível e fácil de usar, bem como sistemas de bombeamento volumosos e caros restringiram aplicações microfluímicas em pesquisas de alta produtividade¹⁰. As configurações de detecção eficientes e a implementação potencialmente difícil nos campos também dificultaram a adoção generalizada de sistemas microfluílicos¹⁰.

De forma contrária, os esferóides gerados em condições não aderentes em misturadores rotativos (nutators), placas de fixação Ultrabaixa e gotas suspensas não incluem componentes de matriz definidos pelo usuário. Essas metodologias são especialmente relevantes para o estudo do câncer de ovário, pois as condições não aderentes são representativas das condições em que os esferóides crescem dentro da cavidade peritoneal⁵. Dentro destes métodos não aderentes da cultura, o pulverizador e os esferoides de gota de suspensão foram mostrados para apresentar uma compactação, uma remodelação, e um quimiorresistência mais elevados comparados aos esferoides gerados em placas ultra-low do acessório, sugerindo o aumento fisiológico relevância^16,17,18,19. Devido à capacidade aumentada para a seleção da elevado-produção dos tamanhos pequenos do poço e dos números de pilha exigidos mínimos, a geração do esferóide em placas de gota de suspensão é uma plataforma ideal para a seleção da droga. Aqui, apresentamos uma plataforma fisiológica 3D sintonável em placas suspensas 384-well penduradas, que é fácil de implementar e altamente receptável à análise a jusante, tornando-a ideal para a triagem de drogas de alto débito de câncer de ovário e CSCs ovariana.

Nossa plataforma fisiológica 3D fornece todas as vantagens da cultura 3D, incluindo contatos fisiológicos de células celulares, gradientes de difusão, densidades de células e proteínas de ECM produzidas naturalmente, que podem contribuir para respostas realistas de drogas^{16, 17,18,19}. Adicionalmente, gerando estes esferoides com CSCS paciente-derivado, nós podemos determinar respostas específicas pacientes às drogas¹ com muitas repetições técnicas simultaneamente, para superar a heterogeneidade que pode ser encontrada dentro do tumor paciente amostras²⁰. Além disso, a cultura 3D demonstrou aumentar a manutenção das populações deCSC^,16 e^,portanto, é representativa de populações de CSC enriquecidas nas ascite⁷. Isto combinado com a análise a jusante fácil, incluindo a análise da citometria do fluxo da viabilidade e das proporções do CSC permite a avaliação óptima do CSC que Sega a eficácia da droga. Por fim, esta plataforma fisiológica é compatível com a imagem em múltiplos pontos temporais durante o experimento, avaliação da morte celular e proliferação, organização celular e morfologia com imunohistoquímica, sinalização solúvel com ELISA em condicionados meio, fenótipos da pilha com cytometry do fluxo, e expressão do gene que segue o PCR.

Protocol

Todas as amostras do paciente são coletadas um protocolo de IRB aprovado dos pacientes de permite encontrem, cujas as amostras são desidentificadas após a coleção debulking e das ascite do tumor. 1. geração de Esferoides de pequenos números de células em 384-bem pendurado drop placas Coloque a placa suspensa pendurada em um sonicador preenchido com água estéril deionizada (di) e proceda por 20 min. Com uma mão enluvado, retire a placa do sonicador e lave-a com ?…

Representative Results

Os esferóides formados com linhagens celulares ou CSCs derivadas de pacientes podem ser formados com uma variedade de pequenos números de células dentro de gotas suspensas (Figura 2a). Os spheroids formam confiantemente com tão poucos quanto 10 pilhas por o poço, que permite a conservação de amostras pacientes raras. Células dentro desses esferóides são cercados por outras células em 3 dimensões como eles estariam in vivo, permitindo que os contatos de células celulares fisioló…

Discussion

O 384-poço pendurado plataforma de placa de queda para a formação de esferóide 3D é uma ferramenta facilmente implementada para qualquer biologia celular ou laboratórios de biologia do câncer. Esta plataforma fisiológica permite o estudo de linhas celulares, bem como, amostras de pacientes primários dentro de culturas 3D fisiologicamente relevantes, permitindo a triagem de drogas de alta taxa de transferência. A plataforma igualmente assegura-se de que as condições da cultura sejam altamente ajustáveis, perm…

Materials

0.25% trypsin-EDTA	Gibco	ILT25200056
10 mL serological pipet	Fisher Scientific	13-678-11E
10,000 cSt Si oil	Millipore Sigma	63148-62-9	Used to coat spheroid array mold to facilitate removal of tissue processing gels, like Histogel, from the mold.
100 mm tissue culture dish	Thermo Scientific	130182
15 ml conical tube	Celltreat	FL4021
1X DMEM for Serum Free Medium	Gibco	11965-092
1X F12 for Serum Free Medium	Gibco	11765-054
1X phosphate buffered saline (PBS)	Gibco	ILT10010023
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Thermo Fisher	D1306
40 µm filter	Fisher Scientific	22363547
6-well plate	Fisher Scientific	353046
Accutase	Innovative Cell Technologies Inc.	1449	A gentle cell detachment enzyme composed of proteolytic and collagenolytic enzymes.
ACK Lysing Buffer	Thermo Scientific	A1049201
alamarBlue	Invitrogen	DAL1025	Resazurin dye used to measure viability and proliferation of cells based on their ability to reduce resazurin to resorufin, which is highly fluorescent.
ALDEFLUOR assay kit	Stem Cell Tech	1700	Kit to identify stem and progenitor cells that express high levels of aldehyde dehydrogenase , an indicator of cancer stem cells. The kit is composed of ALDEFLUOR Reagent, DEAB, Hydrochloric Acid, Dimethylsulphoxide, and ALDEFLUOR Assay Buffer.
ALDEFLUOR Diethylaminobenzaldehyde (DEAB)	Stem Cell Tech	1705	Diethylaminobenzaldehyde (DEAB) is an inhibitor of ALDH isozymes, used to determine non-specific ALDH staining.
Andor iXon x3 CCD Camera	Oxford Instruments	–
Antibiotics and Antimycotics	Gibco	15240-062
APC-isotype IgG2b	Miltenyi biotec	130-092-217	Isotype control to quantify non-specific staining of IgG2b antibodies.
B27 Supplement	Gibco	17504044
basic Fibroblast Growth Factor	Stem Cell Technologies	78003.1
BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes	Fisher Scientific	14-826-79
BioTek Synergy HT Microplate Reader	BioTek	7091000
CD133-APC	Miltenyi biotec	130-113-184	Fluorescent antibody targeting CD133, a cancer stem cell marker.
cellSens Dimension Software	Olympus
Cisplatin	Sigma-Aldrich	P4394	Platinum based chemotherapy agent that functions as an alkylating agent that disrupts DNA.
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Invitrogen	D1306
Epidermal Growth Factor	Gibco	PHG0311
EVOS XL Core Cell Imaging System	Life Technologies	AME3300
Fetal Bovine Serum – premium (FBS)	Atlanta Biologicals	S11150
Ficoll 400	Sigma-Aldrich	F4375
Hemacytometer	Hausser Scientific	1490
Histogel	Thermo Scientific	HG-4000-012	Tissue processing gel that can penetrate and hold the specimen within the gel while preventing discoloration around the specimen upon staining.
Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells	Lonza	PT-5006
Human Microvascular Endothelial Cells	Lonza	CC2543
Insulin-Transferrin-Selenium Supplement	Gibco	51500-056
Live/Dead viability kit	Invitrogen	L3224	Kit for the fluorescence based detection of live (calcein-AM) and dead cells (Ethidium Homodimer-1).
MEM Non-essential Amino Acids	Gibco	11140-050
MetaMorph 7.8 Software	Molecular Devices	–
Olympus IX81 Inverted Confocal Microscope	Olympus	–
Olympus IX83 Research Inverted Microscope	Olympus
Parafilm M	Thomas Scientific	7315D35	Thermoplastic polymer strips that serve to limit droplet evaporation in hanging drop plates while still allowing for gas exchange.
Perfecta 3D 384 Well Hanging Drop Plates	3D Biomatrix	HDP1384-8	Available through Sigma-Aldrich
phalloidin AlexaFluor488	Invitrogen	A12379	Phalloidin is a peptide to fluorescently label F-actin in fixed cells.
ProJet 3500 HD Max	3D Systems	–	3D printer
Sterile DI water	Fisher Scientific	353046
Trypan Blue	Gibco	15250061	Azo dye used to differentiate between live and dead cells based on its ability to pass through the damaged membrane of dead cells, but not the intact membrane of live cells.
VisiJet M3 Crystal	3D Systems	–	A biocompatible polymer material for 3D printing.
Yokogawa CSU-X1 Confocal Scanner Unit	Yokogawa	–