Paisidio Paciente Derivado Esferoides 3D para la detección de drogas antineoplásicas para apuntar a las células madre del cáncer
Summary
Este protocolo describe la generación de esferoides derivados del paciente, y el análisis posterior, incluyendo la cuantificación de la proliferación, las pruebas de citotoxicidad, la citometría de flujo, la tinción de inmunofluorescencia y la toma de imágenes confocales, con el fin de evaluar la droga potencial de los candidatos como terapias antineoplásicas. Este protocolo apoya la medicina de precisión con la identificación de medicamentos específicos para cada paciente y etapa de la enfermedad.
Abstract
En este protocolo, delineamos el procedimiento para la generación de esferoides tumorales dentro de gotas colgantes de 384 pozos para permitir la detección de alto rendimiento de las terapias contra el cáncer en un microambiente fisiológicamente representativo. Delineamos la formación de esferoides de células madre de cáncer derivados del paciente, así como la manipulación de estos esferoides para un análisis exhaustivo después del tratamiento farmacológico. Específicamente, describimos la recopilación de morfología esferoide, proliferación, viabilidad, toxicidad de fármacos, fenotipo celular y datos de localización celular. Este protocolo se centra en gran medida en las técnicas de análisis que se implementan fácilmente utilizando la plataforma de caída colgante de 384 pozos, por lo que es ideal para la detección de drogas de alto rendimiento. Si bien enfatizamos la importancia de este modelo en los estudios de cáncer de ovario y la investigación de células madre del cáncer, la plataforma de 384 pozos es susceptible a la investigación de otros tipos de cáncer y modelos de enfermedades, extendiendo la utilidad de la plataforma a muchos campos. Al mejorar la velocidad del cribado personalizado de drogas y la calidad de los resultados de cribado a través de cultivos 3D fisiológicamente representativos de fácil implementación, se prevé que esta plataforma ayude al desarrollo de nuevas terapias y estrategias de tratamiento, y por lo tanto tienen un amplio impacto clínico.
Introduction
La mortalidad mundial relacionada con el cáncer alcanzó unpeaje de 9,8 millones de muertes en 2018 1, lo que puso de relieve la necesidad de mejorar la terapia. Desafortunadamente, el costo del desarrollo de medicamentos contra el cáncer está aumentando, y el desarrollo de un solo medicamento cuesta aproximadamente 650 millones de dólares,lo que indica la necesidad de mejorar las estrategias para desarrollar nuevos medicamentos contra el cáncer. Se cree que las células madre cancerosas (CSC), que se caracterizan por un aumento de la quimiorresistencia3,la capacidad de auto-renovarse y la capacidad de sembrar nuevos tumores4 son responsables de la recurrencia tumoral4, la metástasis5y quimiorresistencia4,6, que todos contribuyen a la capacidad maligna del tumor y por lo tanto el alto número de muertes. En el cáncer de ovario, estas células se encuentran enriquecidas en el líquido de ascitis maligna en la cavidad peritoneal, una condición asociada con resultados clínicos deficientes1. Como resultado de las capacidades malignas de las CSC, se ha producido un impulso para desarrollar nuevos fármacos dirigidos a la CSC para su uso en combinación con las quimioterapias tradicionales. Existen varios desafíos que acompañan al desarrollo de medicamentos dirigidos a la CSC, entre ellos: 1) dificultad para ampliar y mantener las CSC in vitro; 2) escasez de muestras de pacientes; 3) relevancia fisiológica de la plataforma de cultivo; y 4) heterogeneidad en la sensibilidad a los medicamentos entre los pacientes. Este protocolo describe la implementación de una plataforma de cultivo 3D de alto rendimiento que puede superar cada uno de estos desafíos. En particular, este sistema permite un cribado rápido de fármacos utilizando un pequeño número de CI de ovario derivados del paciente, y es altamente susceptible a las técnicas de análisis aguas abajo. Si bien es ideal para estudiar el cáncer de ovario y los CSC, nuestra plataforma también es valiosa para estudiar otros tipos de cáncer y células diferenciadas en entornos 3D complejos.
Los modelos tridimensionales complejos (3D) son fundamentales en el estudio del microambiente tumoral (TME), que es un nicho 3Dcompuesto por células cancerosas, células que no son compatibles con el cáncer y proteínas de matriz extracelular (ECM) 4. Este entorno 3D da como resultado morfología celular única, interacciones de células celulares y matrices celulares, diferenciacióncelular, migración celular, densidad celular y gradientes de difusión en comparación con el cultivo celular 2D tradicional in vitro 4. Todos estos factores culminan en la respuesta diferencial a los fármacos dentro de los cultivos 3D, exhibiendo una mayor resistencia a los medicamentos y relevancia fisiológica7,8. Debido al papel del TME 3D en la diferenciación y quimiorresistencia de CSC, es vital detectar fármacos dirigidos a CSC en microambientes fisiológicos. Mejorar la relevancia fisiológica de las plataformas de detección de fármacos de CSC tiene el potencial de mejorar la detección de medicamentos específicos para los pacientes, el desarrollo de fármacos, la formulación de estrategias de tratamiento y, en última instancia, los resultados clínicos. Es igualmente importante que la plataforma utilizada para la detección de fármacos sea de alto rendimiento y compatible con los métodos de análisis posteriores para minimizar el costo, el tiempo y el tiempo de traducción clínica de los medicamentos prometedores9.
Actualmente, el complejo TME se mantiene mejor para aplicaciones de detección de fármacos a través de modelos in vivo como modelos de tumores singéneos murinos, xenoinjertos derivados de líneas celulares y modelos12de xenoinjertos derivados del paciente (PDX), ya que proporcionan modelos fisiológicos Condiciones. Sin embargo, la naturaleza de bajo rendimiento de estos modelos, así como el costo, el tiempo y los conjuntos de habilidades técnicas que requieren limita su utilidad en aplicaciones rápidas y de alto rendimiento de detección de medicamentos13. Como alternativas a estos modelos in vivo, muchos modelos 3D in vitro que utilizan hidrogeles8, cultivo dentro de dispositivos microfluídicos o dispositivos ‘organ-on-a-chip’10,14,y cultivos no adherentes3,8 también se han desarrollado, debido a su baja barrera de entrada en términos de costo, tiempo y conjunto de habilidades requeridas.
Las plataformas de cultivo de hidrogel son ventajosas en el control fino que se ofrece sobre la composición de la matriz, las propiedades mecánicas y la estructura de la matriz15; sin embargo, pueden inhibir el cultivo celular de alta densidad14. Además, la recolección de células de hidrogeles puede complicar el análisis aguas abajo, debido a los efectos potencialmente nocivos de los métodos de cosecha15. Los dispositivos microfluídicos, por otro lado, son dispositivos de microescala que permiten la detección de salida dentro del mismo dispositivo y para el cultivo celular a escalas fisiológicamente relevantes con un consumo mínimo de reactivos, menor tiempo de reacción, rápida difusión14. Estas características las convierten en plataformas prometedoras para investigar la toxicidad, eficacia y farmacocinética de los medicamentos. Sin embargo, los desafíos del cultivo celular 3D eficiente, cuantificable, reproducible y fácil de usar, así como los sistemas de bombeo voluminosos y costosos han restringido las aplicaciones microfluídicas en la investigación de alto rendimiento10. Las configuraciones de detección eficientes y la implementación potencialmente difícil en todos los campos también han obstaculizado la adopción generalizada de sistemas microfluídicos10.
Por el contrario, los esferoides generados en condiciones no adherentes en mezcladores giratorios (nutators), placas de fijación ultrabajas y gotas colgantes no incluyen componentes de matriz definidos por el usuario. Estas metodologías son especialmente relevantes para el estudio del cáncer de ovario, ya que las condiciones no adherentes son representativas de las condiciones en las que los esferoides crecen dentro de la cavidad peritoneal5. Dentro de estos métodos de cultivo no adherentes, se ha demostrado que los esferoides de caóro de nuez y gota colgante exhiben una mayor compactación, remodelación y quimiorresistencia en comparación con los esferoides generados en placas de unión ultrabajas, lo que sugiere un aumento fisiológico relevancia16,17,18,19. Debido al aumento de la capacidad de cribado de alto rendimiento de tamaños de pozos más pequeños y números de celda mínimos requeridos, la generación de esferoides en placas colgantes es una plataforma ideal para la detección de drogas. Aquí, presentamos una plataforma fisiológica 3D ajustable en placas colgantes colgantes de 384 pocillos, que es fácil de implementar y altamente susceptible de análisis aguas abajo, por lo que es ideal para la detección de fármacos de alto rendimiento de cáncer de ovario y CSC ováricos.
Nuestra plataforma fisiológica 3D proporciona todas las ventajas del cultivo 3D, incluyendo contactos fisiológicos de células celulares, gradientes de difusión, densidades celulares y proteínas ECM producidas naturalmente, que pueden contribuir a respuestas realistas de drogas16, 17,18,19. Además, al generar estos esferoides con CI derivados del paciente, somos capaces de determinar las respuestas específicas del paciente a los medicamentos1 con muchas réplicas técnicas simultáneamente, para superar la heterogeneidad que se puede encontrar dentro del tumor del paciente muestras20. Además, se ha demostrado que el cultivo 3D mejora el mantenimiento de las poblaciones de CSC3,16 y, por lo tanto, es representativo de las poblaciones de CSC enriquecidas en la ascitis7. Esto combinado con un fácil análisis aguas abajo, incluyendo el análisis de citometría de flujo de viabilidad y proporciones CSC permite una evaluación óptima de la CSC dirigida a la eficacia de los medicamentos. Por último, esta plataforma fisiológica es compatible con imágenes en múltiples momentos durante el experimento, evaluación de la muerte celular y proliferación, organización celular y morfología con inmunohistoquímica, señalización soluble con ELISA en fenotipos de células medianas con citometría de flujo y expresión génica después de la PCR.
Protocol
Representative Results
Discussion
La plataforma de placacolgante colgante de 384 pocillos para la formación de esferoides 3D es una herramienta fácilmente implementada para cualquier laboratorio de biología celular o biología del cáncer. Esta plataforma fisiológica permite el estudio de líneas celulares, así como muestras de pacientes primarios dentro de cultivos 3D fisiológicamente relevantes, al tiempo que permite la detección de fármacos de alto rendimiento. La plataforma también garantiza que las condiciones de cultivo sean altamente ajus…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo es apoyado principalmente por DOD OCRP Early Career Investigator Award W81XWH-13-1-0134(GM), DOD Pilot award W81XWH-16-1-0426 (GM), DOD Investigator Initiated award W81XWH-17-OCRP-IIRA (GM), Rivkin Center for Ovarian Cancer y Michigan Ovarian Cancer Alianza. La investigación reportada en esta publicación fue apoyada por el Instituto Nacional del Cáncer de los Institutos Nacionales de Salud bajo el número de premio P30CA046592. CMN cuenta con el apoyo de la Beca de Investigación de Posgrado de la Fundación Nacional de Ciencias bajo la Beca Grant No. 1256260. MEB cuenta con el apoyo de la beca del Departamento de Educación para graduados en áreas de necesidad nacional (GAANN).
Materials
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco | ILT25200056 | |
| 10 mL serological pipet | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| 10,000 cSt Si oil | Millipore Sigma | 63148-62-9 | Used to coat spheroid array mold to facilitate removal of tissue processing gels, like Histogel, from the mold. |
| 100 mm tissue culture dish | Thermo Scientific | 130182 | |
| 15 ml conical tube | Celltreat | FL4021 | |
| 1X DMEM for Serum Free Medium | Gibco | 11965-092 | |
| 1X F12 for Serum Free Medium | Gibco | 11765-054 | |
| 1X phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | ILT10010023 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher | D1306 | |
| 40 µm filter | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 6-well plate | Fisher Scientific | 353046 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies Inc. | 1449 | A gentle cell detachment enzyme composed of proteolytic and collagenolytic enzymes. |
| ACK Lysing Buffer | Thermo Scientific | A1049201 | |
| alamarBlue | Invitrogen | DAL1025 | Resazurin dye used to measure viability and proliferation of cells based on their ability to reduce resazurin to resorufin, which is highly fluorescent. |
| ALDEFLUOR assay kit | Stem Cell Tech | 1700 | Kit to identify stem and progenitor cells that express high levels of aldehyde dehydrogenase , an indicator of cancer stem cells. The kit is composed of ALDEFLUOR Reagent, DEAB, Hydrochloric Acid, Dimethylsulphoxide, and ALDEFLUOR Assay Buffer. |
| ALDEFLUOR Diethylaminobenzaldehyde (DEAB) | Stem Cell Tech | 1705 | Diethylaminobenzaldehyde (DEAB) is an inhibitor of ALDH isozymes, used to determine non-specific ALDH staining. |
| Andor iXon x3 CCD Camera | Oxford Instruments | – | |
| Antibiotics and Antimycotics | Gibco | 15240-062 | |
| APC-isotype IgG2b | Miltenyi biotec | 130-092-217 | Isotype control to quantify non-specific staining of IgG2b antibodies. |
| B27 Supplement | Gibco | 17504044 | |
| basic Fibroblast Growth Factor | Stem Cell Technologies | 78003.1 | |
| BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes | Fisher Scientific | 14-826-79 | |
| BioTek Synergy HT Microplate Reader | BioTek | 7091000 | |
| CD133-APC | Miltenyi biotec | 130-113-184 | Fluorescent antibody targeting CD133, a cancer stem cell marker. |
| cellSens Dimension Software | Olympus | ||
| Cisplatin | Sigma-Aldrich | P4394 | Platinum based chemotherapy agent that functions as an alkylating agent that disrupts DNA. |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| Epidermal Growth Factor | Gibco | PHG0311 | |
| EVOS XL Core Cell Imaging System | Life Technologies | AME3300 | |
| Fetal Bovine Serum – premium (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Ficoll 400 | Sigma-Aldrich | F4375 | |
| Hemacytometer | Hausser Scientific | 1490 | |
| Histogel | Thermo Scientific | HG-4000-012 | Tissue processing gel that can penetrate and hold the specimen within the gel while preventing discoloration around the specimen upon staining. |
| Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells | Lonza | PT-5006 | |
| Human Microvascular Endothelial Cells | Lonza | CC2543 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium Supplement | Gibco | 51500-056 | |
| Live/Dead viability kit | Invitrogen | L3224 | Kit for the fluorescence based detection of live (calcein-AM) and dead cells (Ethidium Homodimer-1). |
| MEM Non-essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | |
| MetaMorph 7.8 Software | Molecular Devices | – | |
| Olympus IX81 Inverted Confocal Microscope | Olympus | – | |
| Olympus IX83 Research Inverted Microscope | Olympus | ||
| Parafilm M | Thomas Scientific | 7315D35 | Thermoplastic polymer strips that serve to limit droplet evaporation in hanging drop plates while still allowing for gas exchange. |
| Perfecta 3D 384 Well Hanging Drop Plates | 3D Biomatrix | HDP1384-8 | Available through Sigma-Aldrich |
| phalloidin AlexaFluor488 | Invitrogen | A12379 | Phalloidin is a peptide to fluorescently label F-actin in fixed cells. |
| ProJet 3500 HD Max | 3D Systems | – | 3D printer |
| Sterile DI water | Fisher Scientific | 353046 | |
| Trypan Blue | Gibco | 15250061 | Azo dye used to differentiate between live and dead cells based on its ability to pass through the damaged membrane of dead cells, but not the intact membrane of live cells. |
| VisiJet M3 Crystal | 3D Systems | – | A biocompatible polymer material for 3D printing. |
| Yokogawa CSU-X1 Confocal Scanner Unit | Yokogawa | – |
References
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