Fysiologisk patient härledda 3D spheroids för anti-neoplastisk drog screening för att rikta cancer stamceller

Summary

Detta protokoll beskriver generering av patientbaserade spheroider och analys i senare led, inklusive kvantifiering av proliferation, cytotoxicitetstester, flödescytometri, färgning av immunofluorescensteknik och konfokal avbildning, för att bedöma potentiella kandidater som anti-neoplastiska Therapeutics. Detta protokoll stöder precisionsmedicin med identifiering av specifika läkemedel för varje patient och stadium av sjukdom.

Abstract

I detta protokoll, vi beskriver förfarandet för generering av tumör spheroids inom 384-väl hängande droppar för att möjliggöra hög genomströmning screening av anti-cancer Therapeutics i en fysiologiskt representativ mikromiljö. Vi beskriver bildandet av patient härledda stamceller spheroids, liksom, manipulering av dessa spheroids för grundlig analys efter läkemedelsbehandling. Specifikt, vi beskriver insamling av sfäroid morfologi, proliferation, lönsamhet, läkemedelstoxicitet, cell fenotyp och cell lokaliseringsuppgifter. Detta protokoll fokuserar tungt på analystekniker som enkelt implementeras med hjälp av 384-well hängande Drop plattform, vilket gör den idealisk för hög genomströmning Drug screening. Medan vi betonar vikten av denna modell i äggstockscancer studier och cancer stamcellsforskning, 384-well plattform är mottaglig för forskning av andra cancertyper och modeller sjukdom, utvidga nyttan av plattformen till många områden. Genom att förbättra hastigheten på personlig drog screening och kvaliteten på screening resultat genom lätt genomfört fysiologiskt representativa 3D-kulturer, denna plattform förutspås till stöd i utvecklingen av nya Therapeutics och patientspecifika behandlingsstrategier och har därmed långtgående klinisk effekt.

Introduction

Världsomspännande cancerrelaterad dödlighet nådde en avgift på 9 800 000 dödsfall i 2018¹, belyser behovet av utveckling av förbättrad Therapeutics. Tyvärr, kostnaden för att utveckla cancerläkemedel ökar, med utvecklingen av ett enda läkemedel kostar cirka 650 000 000 USD² visar behovet av förbättrade strategier för att utveckla nya läkemedel mot cancer. Cancer stamceller (CSCs), som kännetecknas av ökad kemoresistens³, förmågan att själv förnya, och förmågan att utsäde nya tumörer⁴ tros vara ansvarig för tumör upprepning⁴, metastaser⁵, och chemoresistance^4,6, som alla bidrar till den maligna kapaciteten hos tumören och därmed den höga dödssiffran. I äggstockscancer, dessa celler finns berikas i den maligna ascites vätskan i bukhålan, ett tillstånd som förknippas med dåliga kliniska utfall¹. Som ett resultat av CSCs: s maligna förmåga har det funnits en knuff för att utveckla nya CSC-inriktade läkemedel som ska användas tillsammans med traditionella kemoterapier. Det finns flera utmaningar som åtföljer utvecklingen av CSC inriktade på läkemedel, inklusive: 1) svårigheter att utvidga och underhålla CSCs in vitro; 2) brist på patientprover; 3) kultur plattformens fysiologiska relevans. och 4) heterogenitet i läkemedels känslighet mellan patienter. Detta protokoll beskriver implementeringen av en hög genomströmning 3D-kulturplattform som kan övervinna var och en av dessa utmaningar. I synnerhet, detta system möjliggör snabb drog screening med ett litet antal patient-härledda ovariella CSCs, och är mycket mottagliga för nedströms analystekniker. Även idealisk för att studera äggstockscancer och CSCs, vår plattform är också värdefullt att studera andra cancerformer och differentierade celltyper i komplexa 3D-miljöer.

Komplexa 3-dimensionell (3D) modeller är avgörande för att studera tumören mikromiljö (TME), som är en 3D-nisch som består av cancerceller, icke-cancerstödjande celler, och extracellulära matrix (ECM) proteiner⁴. Denna 3D-miljö resulterar i unika cellmorfologi, cell-cell-och cell-matris interaktioner, celldifferentiering, cell migration, celltäthet, och diffusion gradienter jämfört med traditionell 2D-cellkultur in vitro-⁴. Alla dessa faktorer kulminerar i differential drog svar inom 3D-kulturer, uppvisar ökad resistens och fysiologisk relevans^7,8. På grund av den roll som 3D TME i CSC differentiering och chemoresistance, är det viktigt att skärmen för CSC inriktning läkemedel i fysiologisk mikromiljöer. Förbättra den fysiologiska relevansen av CSC Drug screening plattformar har potential att förbättra patientspecifik läkemedels screening, läkemedelsutveckling, formulering av behandlingsstrategier, och i slutändan kliniska resultat. Det är lika viktigt att den plattform som används för läkemedels screening vara hög genomströmning och kompatibel med nedströms analysmetoder för att minimera kostnader, tid och klinisk översättning tid av lovande läkemedel⁹.

För närvarande är den komplexa TME bäst upprätthålls för Drug screening applikationer genom in vivo modeller såsom murin uterustransplantat tumörmodeller, cell linje härledda xenografts, och patient-derived xenograft (pdx) modeller¹², eftersom de ger fysiologisk Villkor. Men den låga genomströmning karaktär av dessa modeller, liksom, kostnad, tid och tekniska färdigheter som de kräver begränsar deras nytta i snabb, hög genomströmning Drug screeningprogram¹³. Som alternativ till dessa in vivo modeller, många in vitro-3D-modeller som använder hydrogeler⁸, kultur inom mikroflödessystem enheter eller “organ-on-a-chip” enheter^10,14, och icke-anhängare kulturer^3,8 har också utvecklats, på grund av deras låga inträdeshinder i termer av kostnad, tid, och krävs skillset.

Hydrogel kulturplattformar är fördelaktiga för den fina kontroll som ges över matrisens sammansättning, mekaniska egenskaper och matrisens struktur¹⁵; men de kan hämma hög densitet cellkultur¹⁴. Dessutom kan skörd celler från hydrogeler försvåra nedströms analys, på grund av potentiellt skadliga effekter av skördemetoder¹⁵. Microfluidic enheter, å andra sidan, är mikroanalys enheter som möjliggör utdata detektering inom samma enhet och för cellodling i fysiologiskt relevanta skalor med minimal konsumtion av reagens, minskad reaktionstid, minimerat avfall, och snabb diffusion¹⁴. Dessa egenskaper gör dem lovande plattformar för undersökning av läkemedelstoxicitet, effekt och farmakokinetik. Men utmaningarna med effektiv, kvantifierbar, reproducerbar och användarvänlig 3D-cellkultur, liksom, skrymmande och kostsamma pumpsystem har begränsat mikrofluidic applikationer i hög kapacitet forskning¹⁰. Effektiva detekterings inställningar och potentiellt svåra genomförande över fält har också hindrat utbredd användning av mikroflödessystem system¹⁰.

I motsats, spheroids genereras i icke-adherent villkor i roterande blandare (nutators), ultra-låg tillbehör tallrikar, och hängande droppar inte innehåller användardefinierade Matrix komponenter. Dessa metoder är särskilt relevanta för att studera äggstockscancer eftersom de icke-adherenta villkor är representativa för de förhållanden där spheroids växa inom bukhålan⁵. Inom dessa icke-anhängare kultur metoder, nutator och hängande Drop spheroids har visat sig uppvisa högre kompaktionsförmåga, remodeling, och kemoresistens jämfört med spheroids genereras i ultra-låg fästplattor, vilket tyder på ökad fysiologiska relevans^16,17,18,19. På grund av ökad kapacitet för hög genomflöde screening från mindre bra storlekar och minimala krävs cell nummer, sfäroid generation i hängande Drop tallrikar är en idealisk plattform för Drug screening. Här presenterar vi en avstämbara 3D fysiologisk plattform i 384-väl hängande Drop tallrikar, som är lätt att implementera och mycket mottagliga för nedströms analys, vilket gör den idealisk för hög genomströmning Drug screening av äggstockscancer och ovariella CSCs.

Vår 3D-fysiologisk plattform ger alla fördelar med 3D-kulturen, inklusive fysiologiska cell cells kontakter, diffusions gradienter, cell tätheter och naturligt producerade ECM-proteiner, som kan bidra till realistiska läkemedelssvar^{16, 17,18,19}. Dessutom, genom att generera dessa spheroids med patient-derived CSCs, vi har möjlighet att bestämma patientens specifika svar på läkemedel¹ med många tekniska replikat samtidigt, att övervinna heterogenitet som kan hittas inom patientens tumör prover²⁰. Dessutom har 3D-kultur visat sig förbättra underhållet av CSC populationer^3,16 och därmed är representativ för berikade CSC populationer i ascites⁷. Detta kombinerat med lätt nedströms analys, inklusive flödescytometri analys av lönsamhet och CSC proportioner möjliggör optimal utvärdering av CSC inriktning läkemedels effektivitet. Slutligen är denna fysiologisk plattform kompatibel med avbildning vid flera tidpunkter under experimentet, utvärdering av celldöd och proliferation, cell organisation och morfologi med immunohistokemi, löslig signalering med ELISA på konditionerade cell fenotyper med flödescytometri och genuttryck efter PCR.

Protocol

Alla patientprover samlas in enligt en godkänd IRB protokoll från samtyckande patienter, vars prover är de-identifierade efter tumör debulk och ascites samling. 1. generering av spheroids från små cell nummer i 384-väl hängande Drop tallrikar Placera den hängande dropp plattan i en sonikator fylld med sterilt avjoniserat (DI) vatten och Sonikera i 20 minuter. Med en handgjord hand, ta bort plattan från sonikatorn och tvätta den med rinnande DI-vatten. L…

Representative Results

Spheroids bildas med cellinjer eller patient-derived CSCs kan bildas med en rad små cell nummer inom hängande droppar (figur 2A). Spheroids bildar tillförlitligt med så få som 10 celler per brunn, vilket gör det möjligt för bevarande av sällsynta patientprover. Celler inom dessa spheroids är omgivna av andra celler i 3 dimensioner som de skulle vara in vivo, vilket möjliggör fysiologisk cell-Cellkontakter och diffusions hastigheter. Tumörceller inom spheroids föröka orsakar sp…

Discussion

Den 384-well hängande Drop Plate plattform för 3D sfäroid formation är ett lätt genomfört verktyg för alla cellbiologi eller cancer biologi laboratorier. Denna fysiologisk plattform gör det möjligt att studera cellinjer, samt, primära patientprover inom fysiologiskt relevanta 3D-kulturer samtidigt som det möjliggör hög genomströmning Drug screening. Plattformen säkerställer också att odlingsförhållandena är mycket avstämbara, vilket möjliggör en stram kontroll över beläggnings tätheter, cell sam…

Materials

0.25% trypsin-EDTA	Gibco	ILT25200056
10 mL serological pipet	Fisher Scientific	13-678-11E
10,000 cSt Si oil	Millipore Sigma	63148-62-9	Used to coat spheroid array mold to facilitate removal of tissue processing gels, like Histogel, from the mold.
100 mm tissue culture dish	Thermo Scientific	130182
15 ml conical tube	Celltreat	FL4021
1X DMEM for Serum Free Medium	Gibco	11965-092
1X F12 for Serum Free Medium	Gibco	11765-054
1X phosphate buffered saline (PBS)	Gibco	ILT10010023
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Thermo Fisher	D1306
40 µm filter	Fisher Scientific	22363547
6-well plate	Fisher Scientific	353046
Accutase	Innovative Cell Technologies Inc.	1449	A gentle cell detachment enzyme composed of proteolytic and collagenolytic enzymes.
ACK Lysing Buffer	Thermo Scientific	A1049201
alamarBlue	Invitrogen	DAL1025	Resazurin dye used to measure viability and proliferation of cells based on their ability to reduce resazurin to resorufin, which is highly fluorescent.
ALDEFLUOR assay kit	Stem Cell Tech	1700	Kit to identify stem and progenitor cells that express high levels of aldehyde dehydrogenase , an indicator of cancer stem cells. The kit is composed of ALDEFLUOR Reagent, DEAB, Hydrochloric Acid, Dimethylsulphoxide, and ALDEFLUOR Assay Buffer.
ALDEFLUOR Diethylaminobenzaldehyde (DEAB)	Stem Cell Tech	1705	Diethylaminobenzaldehyde (DEAB) is an inhibitor of ALDH isozymes, used to determine non-specific ALDH staining.
Andor iXon x3 CCD Camera	Oxford Instruments	–
Antibiotics and Antimycotics	Gibco	15240-062
APC-isotype IgG2b	Miltenyi biotec	130-092-217	Isotype control to quantify non-specific staining of IgG2b antibodies.
B27 Supplement	Gibco	17504044
basic Fibroblast Growth Factor	Stem Cell Technologies	78003.1
BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes	Fisher Scientific	14-826-79
BioTek Synergy HT Microplate Reader	BioTek	7091000
CD133-APC	Miltenyi biotec	130-113-184	Fluorescent antibody targeting CD133, a cancer stem cell marker.
cellSens Dimension Software	Olympus
Cisplatin	Sigma-Aldrich	P4394	Platinum based chemotherapy agent that functions as an alkylating agent that disrupts DNA.
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Invitrogen	D1306
Epidermal Growth Factor	Gibco	PHG0311
EVOS XL Core Cell Imaging System	Life Technologies	AME3300
Fetal Bovine Serum – premium (FBS)	Atlanta Biologicals	S11150
Ficoll 400	Sigma-Aldrich	F4375
Hemacytometer	Hausser Scientific	1490
Histogel	Thermo Scientific	HG-4000-012	Tissue processing gel that can penetrate and hold the specimen within the gel while preventing discoloration around the specimen upon staining.
Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells	Lonza	PT-5006
Human Microvascular Endothelial Cells	Lonza	CC2543
Insulin-Transferrin-Selenium Supplement	Gibco	51500-056
Live/Dead viability kit	Invitrogen	L3224	Kit for the fluorescence based detection of live (calcein-AM) and dead cells (Ethidium Homodimer-1).
MEM Non-essential Amino Acids	Gibco	11140-050
MetaMorph 7.8 Software	Molecular Devices	–
Olympus IX81 Inverted Confocal Microscope	Olympus	–
Olympus IX83 Research Inverted Microscope	Olympus
Parafilm M	Thomas Scientific	7315D35	Thermoplastic polymer strips that serve to limit droplet evaporation in hanging drop plates while still allowing for gas exchange.
Perfecta 3D 384 Well Hanging Drop Plates	3D Biomatrix	HDP1384-8	Available through Sigma-Aldrich
phalloidin AlexaFluor488	Invitrogen	A12379	Phalloidin is a peptide to fluorescently label F-actin in fixed cells.
ProJet 3500 HD Max	3D Systems	–	3D printer
Sterile DI water	Fisher Scientific	353046
Trypan Blue	Gibco	15250061	Azo dye used to differentiate between live and dead cells based on its ability to pass through the damaged membrane of dead cells, but not the intact membrane of live cells.
VisiJet M3 Crystal	3D Systems	–	A biocompatible polymer material for 3D printing.
Yokogawa CSU-X1 Confocal Scanner Unit	Yokogawa	–