Her presenterer vi en protokoll for å kvantifisere den chemotactic aktiviteten av blod monocytter i musemodeller, for å vurdere virkningene av ernæringsmessige, farmakologiske og genetiske intervensjoner på blod monocytt og å karakterisere blod monocytter avledet makrofager i musemodeller bruker monocytt-chemoattractant protein-1 (MCP-1)-lastet kjeller membran-avledet gel plugger.
Vev homeostase og reparasjon er kritisk avhengig av rekruttering av monocytt-avledede makrofager. Både under-og over-rekruttering av monocytt-avledede makrofager kan svekke sår helbredelse. Vi viste at høyt fett og høyt sukker dietter fremme monocytt grunning og dysfunksjon, konvertere sunne blod monocytter i en hyper chemotactic fenotype klar til å differensiere til makrofager med dysregulated aktivisering profiler og nedsatt fenotypiske Plastisitet. De over-rekruttering av monocytt-avledede makrofager og rekruttering av makrofager med dysregulated aktiverings profiler antas å være en stor bidragsyter til utviklingen av kroniske inflammatoriske sykdommer forbundet med metabolske forstyrrelser, inkludert åreforkalkning og fedme. Målet med denne protokollen er å kvantifisere chemotactic aktivitet av blod monocytter som en biomarkør for monocytt grunning og dysfunksjon og å karakterisere den macrophage fenotype blod monocytter er klar til å differensiere til i disse musemodeller. Ved hjelp av én celle Western Blot analyse, viser vi at etter 24 h 33% av cellene rekruttert til MCP-1-Loaded kjeller membran-avledet gel plugger injisert i mus er monocytter og makrofager; 58% etter dag 3. Men på dag 5 ble monocytt og macrophage tall betydelig redusert. Til slutt viser vi at denne analysene også gir mulighet for isolering av levende makrofager fra kirurgisk Hentet kjeller membran-avledet gel plugger, som deretter kan utsettes for påfølgende karakterisering av enkelt celle Western Blot analyse.
Rekrutteringen av monocytt-avledet makrofager er viktig for utviklingen av kroniske inflammatoriske sykdommer forbundet med metabolske forstyrrelser, inkludert aterosklerose og fedme1,2,3, firetil. Antall monocytt-avledet makrofager på områder av vevskader, så vel som deres plastisitet er avgjørende for vevet homeostase og reparasjon. Både under-og over-rekruttering av monocytt-avledede makrofager kan svekke såret healing5. Utløse lokale vev betennelse, for eksempel ved akkumulering og oksidasjon av lav tetthet lipoprotein (LDL) i aorta veggen eller inflammatorisk aktivering av adipocytter av fettsyrer eller bakteriell lipopolysakkarid lekker gjennom intestinal barriere, fører til utgivelsen av inflammatoriske meglere, inkludert chemokiner som monocytt chemoattractant protein-1 (MCP-1/CCL2). MCP-1 er medlem av c-C chemokine-familien og en nøkkel chemoattractant som er ansvarlig for rekrutteringen av monocytt makrofager til områder av vevs betennelse og skade6,7,8, 9,10. Inflammatorisk aktivering av vaskulær endotelet resulterer i uttrykk for adhesjon molekyler som intercellulære vedheft molekyl 1 (ICAM-1) og vaskulær celle vedheft molekyl 1 (VCAM-1)11,12, slik at sirkulerende monocytter aktiveres av MCP-1 å rulle langs, fast holder seg til og deretter transmigrate inn i subendothelial plass12. Infiltrere monocytter differensiere til makrofager, som kan aktiveres i en proinflammatoriske fenotype, kjøring av akutt inflammatorisk prosess. Drevet av mikromiljøet, Pro-inflammatorisk makrofager kan konvertere til betennelser-løse makrofager, som spiller kritiske roller i clearing av inflammatoriske celler, fjerne Pro-inflammatoriske signaler og fullføre vev reparasjon og sår Healing12,13.
Kronisk metabolsk stress primtall monocytter for dramatisk forbedret respons til kjemoterapi-Oktenol og økt monocytt rekruttering, og vi viste at primet monocytter gi opphav til makrofager med dysregulated aktiverings programmer og polarisering statene14,15,16. Monocytt grunning fremmer aterosklerose, fedme, og muligens andre kroniske inflammatoriske sykdommer forbundet med metabolske forstyrrelser som steatohepatitis, nyre sykdommer og muligens kreft. For å vurdere og kvantifisere monocytt grunning i mus modeller av menneskelige sykdommer, utviklet vi en ny teknikk for å vurdere priming staten blod monocytter ved å måle chemotactic aktivitet i vivo14,15,16, 17av dem. Vår tilnærming innebærer injeksjon av kjelleren membran-avledet gel lastet med enten en chemoattractant-vi vanligvis bruker MCP-1-eller kjøretøy i venstre og høyre flanke, henholdsvis av mus. Når nøye injisert subkutant, kjelleren membran-avledet gel vil danne en enkelt plugg, som chemokiner kan spre og opprette en definert chemotactic gradient som ikke er påvirket av metabolsk eller inflammatorisk tilstand av de omkringliggende vev eller mottakerens mus.
Kjelleren membran-avledet gel vi bruker for våre analysen er en solubilized kjeller membran forberedelse Hentet fra Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mus sarkom, en svulst rik på slike ekstracellulære matrise (ECM) proteiner. Denne komplekse protein blandingen inneholder laminin (60%), kollagen IV (30%), bygge bro molekylet entactin (8%), og en rekke vekstfaktorer. The Basement membran Matrix plugg analysen ble opprinnelig utviklet for å undersøke angiogenese som svar på ulike vekstfaktorer18,19. Men for å studere monocytt chemotaxis, er det viktig å bruke vekstfaktor-utarmet kjeller membran-avledet gel for å minimere endothelial celle rekruttering og angiogenese. Hva gjør Matrigel (referert til som kjeller membran-avledet gel heretter) unik og spesielt nyttig er at ved temperaturer under 10 ° c det blir flytende, slik at for chemokiner å bli oppløst. Ved temperaturer over 22 ° c gjennomgår den avledede løsningen i kjelleren raskt en faseovergang og danner en hydrogel. Pluggene kan kirurgisk excised, rengjøres og oppløses med en Bacillus nøytral metalloprotease for å gi enkel celle suspensjoner, som kan analyseres på en fluorescens celle Sorter (FACS), av RNAseq, Single-Cell RNA og en rekke andre omics teknikker. Her beskriver vi bruken av single-Cell Western Blot analyse for karakterisering av cellen populasjoner rekruttert inn i kjelleren membran-avledet gel plugger en, tre eller fem dager etter injeksjon.
Vi utviklet en in vivo chemotaxis analysen, gjør bruk av de unike fysiske egenskapene til kjelleren membran-avledet matrise og evnen til å laste denne unike matrise med chemokiner og injisere den i mus. Analysen tillater oss å vurdere i levende mus responsen av monocytter (og makrofager) til chemokiner, som illustrert her for MCP-1, og virkningene av enten genetisk manipulasjon eller farmakologiske, kosttilskudd og andre miljømessige eksponeringer på monocytt chemotaxis. Fordi chemokine gradient vi skaper i disse musene er i hovedsak upåvirket av genetiske, farmakologiske, kosttilskudd eller miljømessige eksponering, endringer i monocytt chemotactic aktivitet faktisk reflekterer funksjonelle endringer i disse monocytter og, som vi viste tidligere også omprogrammering på både protein og transcriptional Level17,20. Vi rapporterte at metabolsk stress hos mus øker monocytt respons til chemoattractant, og at denne Hyper-chemotactic aktiviteten samsvarer med økt protein S-glutathionylation, en reversibel, Redox avhengig posttranslational protein modifikasjon, som i de fleste tilfeller fører til tap av enzymatisk og protein funksjon21,22, og i noen tilfeller selv fremmer protein degradering16,23.
For å kunne utføre denne prosedyren, og for å oppnå optimale resultater med denne analysen er det avgjørende at nøyaktige volumer av kjelleren membran-avledet løsning injiseres langsomt for å lage en entall-formet plugg og fiber kapsler bør fjernes helt for å få rene plugger når innhøstingen kjeller membran-avledet gel plugger, forenkler oppløsningen av hele pluggen i dispase løsningen. Våre data viser at å forlate pluggen i dyr i tre dager optimaliserer 1) signalet intensitet, det vil si antall monocytter og makrofager rekruttert inn i hver plugg, 2) selektivitet av signalet, dvs, innholdet av monocytter og makrofager i Totalt celle populasjoner og 3) det spesielle ved signalet, det vil si økningen i monocytter og makrofager som svar på MCP-1 sammenlignet med kjøretøy. Til slutt viser vi hvordan State-of-the-art enkelt celle-baserte tilnærminger i forbindelse med kjelleren membran-avledet gel plug analysen kan brukes til å karakterisere monocytter rekruttert inn i pluggene og dermed få et øyeblikksbilde av den potensielle fenotype av den monocytt-avledede makrofager blir rekruttert til nettsteder for skade i en gitt mus modell som svar på spesifikke genetiske, farmakologiske, kosttilskudd eller miljømessige intervensjoner.
Det finnes en rekke begrensninger av analysen som skal vurderes. Først, mus håndtering, inkludert anestesi, injeksjon av kjeller membran-avledet løsning, og kirurgiske disseksjon krever praksis for å generere enkelt plugger og reproduserbar data. Andre, mens de fleste cellene rekruttert i MCP-1 lastet plugger er monocytter og makrofager, et betydelig antall er det ikke. Dette kan påvirke tolkningen av andre, ikke-single-Cell basert analytiske analyser utført på denne cellen befolkningen. Til slutt, siden cellelyse Rings betingelsene for scWB er milde, kan overførings avstander av proteiner avvike fra standard WB og kan ikke relateres til protein størrelsen. Derfor må både cellelyse og operasjonstider valideres for hvert nye protein som skal testes, og hvert primære antistoff brukes.
The authors have nothing to disclose.
Dette prosjektet ble støttet av tilskudd til R.A. fra NIH (AT006885).
10 cm petri dish | griner bio-one | 664 160 | |
10x suspension buffer | proteinsimple | R101 | |
15 cm petri dish | Falcon | 353025 | |
2-Mercaptoethanol | MP BIOMEDICALS | 2194705 | |
5% washing buffer | proteinsimple | R252 | |
Antibody diluent | proteinsimple | 042-203 | |
Bench Top Centrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 22R Centrifuge | |
Bovine Serim Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-100G | |
Calcein AM | ThermoFisher | C3099 | 1 ml |
CD11b | Novus Biologicals | NB110-89474 | |
CD45 (D4H7K) rabbit mAb | Cell Signal Technologies | 727987S | |
CD68/SR-D1 (FA-11) | Novus Biologicals | NBP2-33337SS | |
Cellometer Vision | Nexcelom | ||
Dispase | BD | 354235 | 100 ml |
Dissecting sissor | |||
Donkey anti-Rabbit IgG secondary antibody [NL557] | Novus Biologicals | NL004 | NL 557 conjugate |
Donkey anti-Rat IgG (H+L) secondary antibody [DyLight 650] | Novus Biologicals | NBP1-75655 | DyLight 650 conjugate |
F4/80 (CI-A3-1) | Novus Biologicals | NB600-404SS | |
Heat Block | effendorf | 22331 | Thermomixer |
Lysis/Running buffer | proteinsimple | R200 | |
Matrigel Matrix (Grwoth Factor Reduced) | BD | 354230 | 10 ml |
Microarray scanner | PerkinElmer | ScanArray Gx | |
Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
Microscope | ThermoFisher | Evos fl | |
Milo | proteinsimple | Single cell western | |
Needle | BD | 305111 | 26G |
Parafilm | |||
Probing chamber | proteinsimple | 035-020 | |
Recombinant mouse CCL2/JE/MCP-1 protein | R&D | 479-JE-050 | |
scWEST chip | proteinsimple | C300 | |
Shaker | Bioexpress | Gene mate orbital shaker | |
Single cell western chip canister | proteinsimple | 035-118 | |
Slide spinner | Labnet | C1303-T | |
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Fisher Scientific | BP 166-500 | |
Syringe | BD | 309602 | 1 ml |
Tris-Hydrochloride | Fisher Scientific | BP 153-500 | |
Tweezer | proteinsimple | 035-020 | |
Water bath | ThermoFisher |