प्राकृतिक उत्पाद की खोज के साथ LC-MS/MS नैदानिक फ़्रेग्मेंटेशन फ़िल्टरिंग: Microcystin विश्लेषण के लिए आवेदन
Summary
नैदानिक विखंडन फ़िल्टरिंग, mzmine में कार्यांवित, एक सुरुचिपूर्ण, पोस्ट अधिग्रहण दृष्टिकोण के लिए स्क्रीन LC-ms/दोनों ज्ञात और अज्ञात प्राकृतिक उत्पादों की पूरी कक्षाओं के लिए ms डेटासेट है । यह उपकरण उत्पाद आयनों और/या तटस्थ हानि के लिए MS/MS स्पेक्ट्रा की खोज करता है जिसे विश्लेषक ने यौगिकों के संपूर्ण वर्ग के लिए नैदानिक के रूप में परिभाषित किया है ।
Abstract
प्राकृतिक उत्पादों अक्सर एक ही यौगिक के बजाय संरचनात्मक रूप से इसी तरह के यौगिकों के मिश्रण के रूप में bioसंश्लेषित कर रहे हैं । उनकी आम संरचनात्मक विशेषताओं के कारण, एक ही वर्ग के भीतर कई यौगिकों समान MS/MS फ़्रेग्मेंटेशन गुजरना और कई समान उत्पाद आयनों और/या तटस्थ हानि है । नैदानिक फ़्रेग्मेंटेशन फ़िल्टरिंग (DFF) का उद्देश्य कुशलता से एक जटिल निकालने में दिए गए वर्ग के सभी यौगिकों का पता लगाने के लिए गैर-लक्षित LC-MS/ms डेटासेट MS/MS स्पेक्ट्रा कि वर्ग विशिष्ट उत्पाद आयनों और/या तटस्थ हानि होते हैं । इस विधि एक DFF मुक्त स्रोत MZmine मंच है कि नमूना निष्कर्षों की आवश्यकता है के भीतर लागू मॉड्यूल पर आधारित है डेटा पर निर्भर अधिग्रहण के द्वारा विश्लेषण किया जा एक उच्च संकल्प मास स्पेक्ट्रोमीटर जैसे चतुर्ध्रुव Analyzers. इस दृष्टिकोण की मुख्य सीमा है विश्लेषक पहले परिभाषित करना चाहिए जो उत्पाद आयनों और/या तटस्थ हानि प्राकृतिक उत्पादों के लक्षित वर्ग के लिए विशिष्ट हैं । DFF एक जटिल नमूना के भीतर सभी संबंधित प्राकृतिक उत्पादों के बाद की खोज के लिए अनुमति देता है, नए यौगिकों सहित. इस काम में, हम microcystis aeruginosa की स्क्रीनिंग के अर्क से dff की प्रभावशीलता का प्रदर्शन, एक प्रमुख हानिकारक शैवाल खिलने के कारण cyanobacteria, microcystis के उत्पादन के लिए.
Introduction
अनुबद्ध द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री (MS/MS) एक व्यापक रूप से प्रयुक्त मास स्पेक्ट्रोमेट्री विधि है जिसमें एक पूर्वगामी आयन को अलग-थलग करना और सक्रियण ऊर्जा के अनुप्रयोग के माध्यम से विखंडन उत्प्रेरण करना शामिल है जैसे टक्कर प्रेरित पृथक्करण (सीआईडी)1. एक आयन के टुकड़े को उसके आण्विक संरचना से परिचित करने का तरीका । प्राकृतिक उत्पादों अक्सर एक अद्वितीय रासायनिक2के रूप में के बजाय संरचनात्मक रूप से समान यौगिकों के मिश्रण के रूप में bioसंश्लेषित कर रहे हैं । इस प्रकार, संरचनात्मक रूप से संबंधित यौगिकों कि एक ही तब वर्ग का हिस्सा हैं अक्सर साझा उत्पाद आयनों और/या तटस्थ हानि सहित कुंजी ms/ वर्ग-विशिष्ट उत्पाद आयनों और/या तटस्थ हानि के अधिकारी यौगिकों के लिए जटिल नमूनों स्क्रीन करने की क्षमता यौगिकों के पूरे वर्गों का पता लगाने के लिए एक शक्तिशाली रणनीति है, संभावित रूप से नए प्राकृतिक उत्पादों की खोज करने के लिए अग्रणी3, 4 । , 5 । , 6. दशकों के लिए, तटस्थ हानि स्कैनिंग और अग्रदूत आयन स्कैनिंग कम संकल्प उपकरणों पर प्रदर्शन जैसे मास स्पेक्ट्रोमेट्री तरीकों का पता लगाया जा करने के लिए एक ही तटस्थ हानि या उत्पाद आयनों के साथ आयनों की अनुमति दी है. हालांकि, विशिष्ट आयनों या संक्रमण प्रयोग करने से पहले परिभाषित किया जाना चाहिए । चूंकि उच्च विभेदन वाले मास स्पेक्ट्रोमीटर अनुसंधान प्रयोगशालाओं में अधिक लोकप्रिय हो गए हैं, इसलिए अब गैर-लक्षित, डेटा-निर्भर अधिग्रहण (डीडीए) विधियों का उपयोग करके जटिल नमूनों की जांच की जाती है । पारंपरिक तटस्थ हानि और पूर्वगामी आयन स्कैनिंग के विपरीत संरचनात्मक रूप से संबंधित यौगिकों की पहचान पोस्ट-अधिग्रहण विश्लेषण7द्वारा किया जा सकता है । इस काम में, हम एक रणनीति हम विकसित किया है प्रदर्शन के नैदानिक विखंडन फ़िल्टरिंग (dff)5,6, एक सीधे आगे और उपयोगकर्ता के अनुकूल दृष्टिकोण जटिल matrices के भीतर यौगिकों के पूरे वर्गों का पता लगाने के लिए । इस DFF मॉड्यूल खुला स्रोत, MZmine 2 मंच और MZmine २.३८ या नए रिलीज डाउनलोड करके उपलब्ध में लागू किया गया है. Dff उपयोगकर्ताओं को कुशलता से एमएस के लिए डीडीए डेटासेट स्क्रीन करने के लिए अनुमति देता है/एमएस स्पेक्ट्रा जो उत्पाद आयन (ओं) और/ DFF की एक सीमा विशेषता उत्पाद आयनों और/या यौगिकों के एक वर्ग के लिए तटस्थ नुकसान विश्लेषक द्वारा परिभाषित किया जाना चाहिए है ।
उदाहरण के लिए, अधिक से अधिक ६० अलग fumonisin माइकोटॉक्सिन की पहचानकी 8,9 एक tricarballलिलिक पक्ष श्रृंखला के अधिकारी, कि एक एम १५७.०१४२/ [एम-एच]– आयन4का विखंडन । इसलिए, एक नमूना में सभी ख्यात fumonisins का पता लगाया जा सकता है DFF का उपयोग कर एक डीडीए डाटासेट है कि प्रमुख एम १५७.०१४२/ इसी प्रकार, मैसर्स/एमएस स्पेक्ट्रा के लिए डीडीए डेटासेट की स्क्रीनिंग करके सल्फित यौगिकों का पता लगाया जा सकता है जिसमें ७९.९५७४ डीए (एसओ3)3का नैदानिक तटस्थ नुकसान होता है । इस प्रकिया को नए चक्रीय पेप्टाइड5 और प्राकृतिक उत्पादों का पता लगाने के लिए भी सफलतापूर्वक लागू किया गया है जिनमें ट्रिप्टोफान या फेनिल ऐलानिन अवशेष6हैं ।
DFF की प्रभावशीलता और MZmine मंच10के भीतर उपयोग की अपनी आसानी को प्रदर्शित करने के लिए, हम microcystins (MCs) के विश्लेषण के लिए इस दृष्टिकोण लागू किया है; २४० से अधिक संरचनात्मक रूप से संबंधित विषाक्त पदार्थों के एक वर्ग मीठे पानी साइनोबैक्टीरिया11,12,13द्वारा उत्पादित.
सबसे अधिक सूचित किया सायनोटॉक्सिन MCs हैं, MC-LR के साथ (leucine [L]/arginine [R]) congener अक्सर अध्ययन (चित्रा 1) । एमसीएस, माइक्रोसिस्टिस, ऐनाबीना, नोस्तोक , और प्लकटॉथ्रिक्स12,13सहित बहु सायनोबैक्टीरिया जेनेरा द्वारा बायोसंश्लेषित मोनोसाइक्लिक नॉन राइबोसोमल हेप्टापेप्टाइड हैं । एमसीएस एल-अमीनो अम्ल के पांच सामान्य अवशेष तथा दो परिवर्ती पदों से निर्मित हैं। लगभग सभी MCs एक विशेषता β-अमीनो एसिड 3-अमीनो-9 methoxy-2, 6, 8-trimethyl-10-phenyldeca-4, 6-dienoic एसिड (Adda) की स्थिति 511में अवशेषों के अधिकारी । एमसीएस की एमएस/एमएस फ़्रेग्मेंटेशन मार्ग14,15में भली-भांति वणत हैं; एडीडीए अवशेष प्रमुख एमएस/एमएस उत्पाद आयन, एम/जेड १३५.०८०३+ (सी9एच11ओ+) के साथ-साथ अन्य उत्पाद आयनों के लिए उत्तरदायी है जिसमें एम/जेड १६३.१११४+ (सी11एच15 O+) (चित्र 2) । Microcystis aeruginosa सेलुलर निष्कर्षों के गैर लक्षित डीडीए डेटासेट इन नैदानिक आयनों का उपयोग कर मौजूद सभी microcystis के लिए जांच की जा सकती है, दी है कि microcystis एक adda अवशेष है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
DFF यौगिकों की पूरी कक्षाओं का पता लगाने के लिए एक सीधे आगे और तेजी से रणनीति है, विशेष रूप से प्राकृतिक उत्पाद यौगिक खोज के लिए प्रासंगिक. डीएफएफ का सबसे महत्वपूर्ण पहलू विशिष्ट एमएस/एमएस विखंडन संबंधी म…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक हीथ roshon (कनाडा phyकोलोन संस्कृति केंद्र, साइनोबैक्टीरिया संस्कृति का अध्ययन प्रदान करने के लिए waterloo के विश्वविद्यालय का शुक्र है और (carleton विश्वविद्यालय) तकनीकी सहायता के लिए ।
Materials
| Cyanobacteria | |||
| Microcystis aeruginosaCPCC300 | CANADIAN PHYCOLOGICAL CULTURE CENTRE | CPCC300 | https://uwaterloo.ca/canadian-phycological-culture-centre/ |
| Software | |||
| Proteowizard (software) | software | http://proteowizard.sourceforge.net/ | |
| Mzmine 2 | software | http://mzmine.github.io/ | |
| LC-MS | |||
| Q-Exactive Orbitrap | Thermo | – | Equipped with HESI ionization source |
| 1290 UHPLC | Agilent | Equipped with binary pump, autosampler, column compartment | |
| C18 column | Agilent | 959757-902 | Eclipse Plus C18 RRHD column (2.1 × 100 mm, 1.8 μm) |
| Solvents | |||
| Optima LC-MS grade Methanol | Fisher | A456-4 | |
| OptimaLC-MS grade Acetonitrile | Fisher | A955-4 | |
| OptimaLC-MS grade Water | Fisher | W6-4 | |
| LC-MS grade Formic Acid | Fisher | A11710X1-AMP | |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Centrifuge Sorvall Micro 21 | Thermo Scientific | 75-772-436 | |
| Other | |||
| Amber HPLC vials 2 mL/caps | Agilent | 5182-0716/5182-0717 | |
| 0.2-μm PTFE syringe filters | Pall Corp. | 4521 | |
| Whatman 47mm GF/A glass microfiber filters | Sigma-Aldrich | WHA1820047 | |
| Media | |||
| MA media (pH 8.6) ( quantity / L) | Watanabe, M. F. & Oishi, S. Effects of environmental factors on toxicity of a cyanobacterium (Microcystis aeruginosa) under culture conditions. Applied and Environmental microbiology. 49 (5), 1342-1344 (1985). | ||
| Ca(NO3)·4H2O, 50 mg | Sigma-Aldrich | C2786 | |
| KNO3, 100 mg | Sigma-Aldrich | P8291 | |
| NaNO3, 50 mg | Sigma-Aldrich | S5022 | |
| Na2SO4, 40 mg | Sigma-Aldrich | S5640 | |
| MgCl2·6H20, 50 mg | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Sodium glycerophosphate, 100 mg | Sigma-Aldrich | G9422 | |
| H3BO3, 20 mg | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Bicine, 500 mg | Sigma-Aldrich | RES1151B-B7 | |
| P(IV) metal solution, 5 mL | |||
| Bring the following to 1 L with ddH2O | |||
| NaEDTA·2HO | Sigma-Aldrich | E6635 | |
| FeCl3 ·6H2O | Sigma-Aldrich | 236489 | |
| MnCl2·4H2O | Baker | 2540 | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | Z0152 | |
| CoCl2·6H2O | Sigma-Aldrich | C8661 | |
| Na2MoO4·2H2O | Baker | 3764 | |
| Cyanobacteria BG-11 50X Freshwater Solution | Sigma-Aldrich | C3061-500mL |
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