Naturprodukt opdagelse med LC-MS/MS diagnostisk fragmentering filtrering: ansøgning om Microcystin analyse
Summary
Diagnostisk fragmentering filtrering, implementeret i MZmine, er en elegant, post-erhvervelse tilgang til skærmen LC-MS/MS datasæt for hele klasser af både kendte og ukendte naturlige produkter. Dette værktøj søger MS/MS spektre for produkt ioner og/eller neutrale tab, at analytikeren har defineret som værende diagnostisk for hele klassen af forbindelser.
Abstract
Naturlige produkter er ofte biosyntetiseret som blandinger af strukturelt lignende forbindelser, snarere end en enkelt forbindelse. På grund af deres fælles strukturelle træk, mange forbindelser inden for samme klasse gennemgår samme MS/MS fragmentering og har flere identiske produkt ioner og/eller neutrale tab. Formålet med diagnostisk fragmentering filtrering (DFF) er effektivt at detektere alle forbindelser af en given klasse i en kompleks ekstrakt ved screening ikke-målrettede LC-MS/MS datasæt for MS/MS spektre, der indeholder klasse specifikke produkt ioner og/eller neutrale tab. Denne metode er baseret på et DFF modul implementeret i open source MZmine platform, der kræver prøveekstrakter analyseres ved data-afhængige erhvervelse på en høj opløsning massespektrometer såsom firpol Orbitrap eller firpolet Time-of-Flight masse Analysatorer. Den vigtigste begrænsning af denne tilgang er analytikeren skal først definere, hvilke produkter ioner og/eller neutrale tab er specifikke for den målrettede klasse af naturlige produkter. DFF giver mulighed for efterfølgende opdagelse af alle relaterede naturprodukter i en kompleks prøve, herunder nye forbindelser. I dette arbejde, vi demonstrere effektiviteten af DFF ved screening ekstrakter af microcystis aeruginosa, en fremtrædende skadelige alge flor forårsager cyanobakterier, til produktion af mikrocystiner.
Introduction
Tandem massespektrometri (MS/MS) er en meget udbredt massespektrometri metode, der involverer isolering af en prækursor og inducerende fragmentering via anvendelse af aktiveringsenergi såsom kollisions induceret afkobling (CID)1. Den måde, hvorpå en ion fragmenter er tæt forbundet med sin molekylære struktur. Naturlige produkter er ofte biosyntetiseret som blandinger af strukturelt lignende forbindelser snarere end som en enkelt unik kemisk2. Strukturelt beslægtede stoffer, der er en del af den samme biosyntetiske klasse, deler ofte centrale MS/MS-fragmenterings karakteristika, herunder fælles produktioner og/eller neutrale tab. Evnen til at screene komplekse prøver for forbindelser, der besidder klasse specifikke produkt ioner og/eller neutrale tab er en stærk strategi til at opdage hele klasser af forbindelser, potentielt fører til opdagelsen af nye naturlige produkter3, 4 af , 5 ) i , 6. i årtier har massespektrometri metoder såsom neutral Loss scanning og forløber ion scanning udført på lav opløsning instrumenter tilladt ioner med samme neutrale tab eller produkt ioner, der skal påvises. De specifikke ioner eller overgange skal dog defineres, før forsøgene udføres. Da massespektrometre med høj opløsning er blevet mere populære i forskningslaboratorier, er komplekse prøver nu almindeligt screenet ved hjælp af ikke-målrettede, data-afhængige erhvervelse (DDA) metoder. I modsætning til traditionelle neutrale tab og prækursor scanning, kan strukturelt beslægtede forbindelser identificeres ved post-erhvervelse analyse7. I dette arbejde, vi demonstrere en strategi, vi har udviklet kaldet diagnostisk fragmentering filtrering (DFF)5,6, en straight-Forward og brugervenlig tilgang til at opdage hele klasser af forbindelser inden for komplekse matricer. Dette DFF modul er blevet implementeret i open source, MZmine 2 platform og tilgængelig ved at downloade MZmine 2,38 eller nyere udgivelser. DFF giver brugerne mulighed for effektivt at screene dda-datasæt for MS/MS spektre, som indeholder produkt ion (er) og/eller neutralt tab (er), der er diagnostiske for hele klasser af forbindelser. En begrænsning af DFF er karakteristiske produkt ioner og/eller neutrale tab for en klasse af forbindelser skal defineres af analytikeren.
For eksempel, hver af de mere end 60 forskellige fumonisin mykotoksiner identificeret8,9 besidder en tricarballylic sidekæde, der genererer en m/z 157,0142 (C6H5O5–) produkt ion ved fragmentering af [M-H]– ion4. Derfor kan alle formodede fumonisiner i en prøve påvises ved hjælp af DFF ved screening af alle MS/MS-spektre i et DDA-datasæt, der indeholder den fremtrædende m/z 157,0142-produkt ion. Tilsvarende kan sulferede forbindelser påvises ved screening af dda-datasæt for MS/MS spektre, der indeholder et diagnostisk neutralt tab på 79,9574 da (so3)3. Denne fremgangsmåde er også blevet anvendt med succes til påvisning af nye cykliske peptider5 og naturlige produkter, der indeholder tryptophan eller phenylalanin rester6.
For at demonstrere effektiviteten af DFF og dets brugervenlighed inden for MZmine-platformen10har vi anvendt denne fremgangsmåde til analyse af mikrocystiner (MCS); en klasse af over 240 strukturelt beslægtede toksiner produceret af ferskvands cyanobakterier11,12,13.
De hyppigst rapporterede cyanotoksiner er MCs, med MC-LR (leucin [L]/Arginine [R]) kongener hyppigst undersøgt (figur 1). MCs er monocycliske ikke-ribosomale heptapeptider, biosyntetiseret af flere cyanobakterier slægter, herunder microcystis, Anabaena, Nostoc, og Planktothrix12,13. MCs består af fem almindelige rester og to variable positioner besat af L-aminosyrer. Næsten alle MCs besidder en karakteristisk β-aminosyre 3-amino-9-methoxy-2, 6, 8-trimethyl-10-phenyldeca-4, 6-dienoinsyre (Adda) rest på position 511. MS/MS fragmenterings vejene for MCS er godt beskrevet14,15; Adda rester er ansvarlig for de fremtrædende MS/MS produkt ion, m/z 135,0803+ (C9H11O+) samt andre produkt ioner, herunder m/z 163,1114+ (C11H15 O+) (figur 2). Ikke-målrettede DDA-datasæt for Mikrocystis aeruginosa -cellulære ekstrakter kan screenes for alle mikrocystiner, der er til stede ved hjælp af disse diagnostiske ioner, da mikrocystinerne har en Adda-rest.
Protocol
Representative Results
Discussion
DFF er en straight-Forward og hurtig strategi til påvisning af hele klasser af forbindelser, især relevant for naturlige produkt sammensatte opdagelse. Det vigtigste aspekt af DFF er at definere de specifikke MS/MS fragmentering kriterier for den målrettede klasse af forbindelser. I dette repræsentative eksempel blev DFF anvendt til at påvise alle Adda-rester indeholdende MCs, der fandtes i et M. aeruginosa -celle ekstrakt. Selv om langt størstedelen af MCs indeholder en Adda-rest, har andre rester på den…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Heather Roshon (Canadian Phycological Culture centre, University of Waterloo for at levere cyanobakterier-kulturen undersøgt og Sawsan Abusharkh (Carleton University) for teknisk assistance.
Materials
| Cyanobacteria | |||
| Microcystis aeruginosaCPCC300 | CANADIAN PHYCOLOGICAL CULTURE CENTRE | CPCC300 | https://uwaterloo.ca/canadian-phycological-culture-centre/ |
| Software | |||
| Proteowizard (software) | software | http://proteowizard.sourceforge.net/ | |
| Mzmine 2 | software | http://mzmine.github.io/ | |
| LC-MS | |||
| Q-Exactive Orbitrap | Thermo | – | Equipped with HESI ionization source |
| 1290 UHPLC | Agilent | Equipped with binary pump, autosampler, column compartment | |
| C18 column | Agilent | 959757-902 | Eclipse Plus C18 RRHD column (2.1 × 100 mm, 1.8 μm) |
| Solvents | |||
| Optima LC-MS grade Methanol | Fisher | A456-4 | |
| OptimaLC-MS grade Acetonitrile | Fisher | A955-4 | |
| OptimaLC-MS grade Water | Fisher | W6-4 | |
| LC-MS grade Formic Acid | Fisher | A11710X1-AMP | |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Centrifuge Sorvall Micro 21 | Thermo Scientific | 75-772-436 | |
| Other | |||
| Amber HPLC vials 2 mL/caps | Agilent | 5182-0716/5182-0717 | |
| 0.2-μm PTFE syringe filters | Pall Corp. | 4521 | |
| Whatman 47mm GF/A glass microfiber filters | Sigma-Aldrich | WHA1820047 | |
| Media | |||
| MA media (pH 8.6) ( quantity / L) | Watanabe, M. F. & Oishi, S. Effects of environmental factors on toxicity of a cyanobacterium (Microcystis aeruginosa) under culture conditions. Applied and Environmental microbiology. 49 (5), 1342-1344 (1985). | ||
| Ca(NO3)·4H2O, 50 mg | Sigma-Aldrich | C2786 | |
| KNO3, 100 mg | Sigma-Aldrich | P8291 | |
| NaNO3, 50 mg | Sigma-Aldrich | S5022 | |
| Na2SO4, 40 mg | Sigma-Aldrich | S5640 | |
| MgCl2·6H20, 50 mg | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Sodium glycerophosphate, 100 mg | Sigma-Aldrich | G9422 | |
| H3BO3, 20 mg | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Bicine, 500 mg | Sigma-Aldrich | RES1151B-B7 | |
| P(IV) metal solution, 5 mL | |||
| Bring the following to 1 L with ddH2O | |||
| NaEDTA·2HO | Sigma-Aldrich | E6635 | |
| FeCl3 ·6H2O | Sigma-Aldrich | 236489 | |
| MnCl2·4H2O | Baker | 2540 | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | Z0152 | |
| CoCl2·6H2O | Sigma-Aldrich | C8661 | |
| Na2MoO4·2H2O | Baker | 3764 | |
| Cyanobacteria BG-11 50X Freshwater Solution | Sigma-Aldrich | C3061-500mL |
References
- Mayer, P. M., Poon, C. The mechanisms of collisional activation of ions in mass spectrometry. Mass Spectrometry Reviews. 28 (4), 608-639 (2009).
- Fisch, K. M. Biosynthesis of natural products by microbial iterative hybrid PKS–NRPS. RSC Advances. 3 (40), 18228-18247 (2013).
- Kelman, M. J., et al. Identification of six new Alternaria sulfoconjugated metabolites by high-resolution neutral loss filtering. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 29 (19), 1805-1810 (2015).
- Renaud, J. B., Kelman, M. J., Qi, T. F., Seifert, K. A., Sumarah, M. W. Product ion filtering with rapid polarity switching for the detection of all fumonisins and AAL-toxins. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 29 (22), 2131-2139 (2015).
- Renaud, J. B., Kelman, M. J., McMullin, D. R., Yeung, K. K. -. C., Sumarah, M. W. Application of C8 liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the analysis of enniatins and bassianolides. Journal of Chromatography A. 1508, 65-72 (2017).
- Walsh, J. P., et al. Diagnostic Fragmentation Filtering for the Discovery of New Chaetoglobosins and Cytochalasins. Rapid Communications in Mass Spectrometry. , (2018).
- Wang, M., et al. Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking. Nature biotechnology. 34 (8), 828 (2016).
- Bartók, T., Szécsi, &. #. 1. 9. 3. ;., Szekeres, A., Mesterházy, &. #. 1. 9. 3. ;., Bartók, M. Detection of new fumonisin mycotoxins and fumonisin-like compounds by reversed-phase high-performance liquid chromatography/electrospray ionization ion trap mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry: An International Journal Devoted to the Rapid Dissemination of Up-to-the-Minute Research in Mass Spectrometry. 20 (16), 2447-2462 (2006).
- Bartók, T., et al. Detection and characterization of twenty-eight isomers of fumonisin B1 (FB1) mycotoxin in a solid rice culture infected with Fusarium verticillioides by reversed-phase high-performance liquid chromatography/electrospray ionization time-of-flight and ion trap mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 24 (1), 35-42 (2010).
- Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Orešič, M. MZmine 2: modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data. BMC bioinformatics. 11 (1), 395 (2010).
- Spoof, L., Catherine, A. Appendix 3: tables of microcystins and nodularins. Handbook of cyanobacterial monitoring and cyanotoxin analysis. , 526-537 (2016).
- Pick, F. R. Blooming algae: a Canadian perspective on the rise of toxic cyanobacteria. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 73 (7), 1149-1158 (2016).
- Carmichael, W. W., Boyer, G. L. Health impacts from cyanobacteria harmful algae blooms: Implications for the North American Great Lakes. Harmful algae. 54, 194-212 (2016).
- Mayumi, T., et al. Structural characterization of microcystins by LC/MS/MS under ion trap conditions. The Journal of antibiotics. 59 (11), 710 (2006).
- Frias, H. V., et al. Use of electrospray tandem mass spectrometry for identification of microcystins during a cyanobacterial bloom event. Biochemical and biophysical research communications. 344 (3), 741-746 (2006).
- Kessner, D., Chambers, M., Burke, R., Agus, D., Mallick, P. ProteoWizard: open source software for rapid proteomics tools development. Bioinformatics. 24 (21), 2534-2536 (2008).
- Watanabe, M. F., Oishi, S. Effects of environmental factors on toxicity of a cyanobacterium (Microcystis aeruginosa) under culture conditions. Applied and Environmental microbiology. 49 (5), 1342-1344 (1985).
- Hollingdale, C., et al. Feasibility study on production of a matrix reference material for cyanobacterial toxins. Analytical and bioanalytical chemistry. 407 (18), 5353-5363 (2015).
- Yuan, M., Namikoshi, M., Otsuki, A., Sivonen, K. Effect of amino acid side-chain on fragmentation of cyclic peptide ions: differences of electrospray ionization/collision-induced decomposition mass spectra of toxic heptapeptide microcystins containing ADMAdda instead of Adda. European Mass Spectrometry. 4 (4), 287-298 (1998).
- Schymanski, E., et al. Identifying small molecules via high resolution mass spectrometry: communicating confidence. Environmental science & technology. 48 (4), 2097 (2014).
