גילוי מוצר טבעי עם סינון פיצול LC-MS/MS: בקשה ניתוח Microcystin
Summary
סינון פיצול אבחון, מיושם לתוך MZmine, היא גישה אלגנטית, לאחר הרכישה למסך LC-MS/MS datasets עבור מחלקות שלמות של מוצרים טבעיים ידועים ולא ידועים. כלי זה מחפש את MS/MS ספקטרום עבור יוני מוצרים ו/או הפסדים ניטרליים כי האנליסט הגדיר כאבחון עבור המחלקה כולה של תרכובות.
Abstract
מוצרים טבעיים הם לעתים קרובות biosynthesized סונתז תערובות של תרכובות דומות מבנית, ולא מתחם אחד. בשל תכונות מבניות נפוצות שלהם, תרכובות רבות בתוך אותה מחלקה עוברים פיצול MS/MS דומה ויש להם כמה יונים מוצר זהה ו/או הפסדים ניטרליים. המטרה של סינון פיצול אבחון (DFF) היא לזהות ביעילות את כל התרכובות של מחלקה נתונה בתמצית מורכבת על-ידי הקרנת מערכות נתונים מסוג LC-MS/MS לצורך הגדרת מערך MS/ms, המכילות יוני מוצרים ספציפיים למחלקה ו/או הפסדים ניטרליים. שיטה זו מבוססת על מודול DFF מיושם בתוך פלטפורמת MZmine מקור פתוח הדורש תמציות לדוגמה להיות מנותח על ידי רכישה תלוי נתונים על ספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה, כגון אוריוראפ פי ארבעה או מאסה פי ארבעה של הטיסה. אנלייזרים. המגבלה העיקרית של גישה זו היא שהאנליסט חייב להגדיר תחילה אילו יוני מוצר ו/או הפסדים ניטרליים הם ספציפיים למעמד היעד של מוצרים טבעיים. DFF מאפשר את הגילוי הבא של כל המוצרים הטבעיים הקשורים במדגם מורכב, כולל תרכובות חדשות. בעבודה זו, אנו מדגימים את האפקטיביות של dff על ידי הקרנת תמציות של מיקרוקילף aeruginosa, בולט פריחת אצות בולטים מזיקים גרימת חיידקים, לייצור של microcystins.
Introduction
טנדם המסה (MS/MS) היא בשימוש נרחב ספקטרומטר מסה שיטה הכוללת בידוד יון מקודמת וגורם לפיצול באמצעות יישום של אנרגיה הפעלה כגון התנגשות המושרה (CID)1. האופן שבו שברי יונים מקושרים בצורה אינטימית למבנה המולקולרי שלו. מוצרים טבעיים הם לעתים קרובות biosynthesized סונתז תערובות של תרכובות דומות מבנית ולא כמו כימיקל יחיד ייחודי2. ככאלה, תרכובות קשורות מבנית המהווים חלק מאותה מחלקה biosynthetic לעתים קרובות לשתף מאפיינים מרכזיים MS/MS הפיצול, כולל יוני מוצרים משותפים ו/או הפסדים ניטרליים. היכולת להקרין דגימות מורכבות עבור תרכובות בעלות יוני מוצר ספציפיים לכיתה ו/או הפסדים ניטרליים היא אסטרטגיה רבת עוצמה כדי לזהות מחלקות שלמות של תרכובות, שעשויות להוביל לגילוי של מוצרים טבעיים חדשים3, ד , מיכל 5 , 6. במשך עשרות שנים, שיטות ספקטרומטר המסה כגון סריקת הפסד נייטרלי וסריקת יון מקודמות שבוצעו על מכשירים ברזולוציה נמוכה אפשרה יונים עם הפסד נייטרלי או יוני מוצר זהים להתגלות. עם זאת, היונים או המעברים הספציפיים הנחוצים להגדרה לפני ביצוע הניסויים. כאשר ספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה הפכו לפופולריים יותר במעבדות מחקר, דוגמאות מורכבות מוקרן כעת בדרך כלל באמצעות שיטות רכישה לא ממוקדות ותלויות נתונים. בניגוד לאובדן נייטרלי מסורתי סריקת יון מקודמן, תרכובות קשורות מבנית ניתן לזהות על ידי ניתוח לאחר הרכישה7. בעבודה זו, אנו מוכיחים אסטרטגיה שפיתחנו לסנן פיצול אבחון (dff)5,6, ישר קדימה וידידותי למשתמש גישה לזהות מחלקות שלמות של תרכובות בתוך מטריצות מורכבות. מודול DFF זה כבר יושם לתוך מקור פתוח, MZmine 2 פלטפורמת והוא זמין על ידי הורדת MZmine 2.38 או מהדורות חדשות יותר. DFF מאפשר למשתמשים למסך ביעילות את מערכות הנתונים של ד. א. ל. (MS/MS ספקטרה המכילים את יון מוצר (ים) ו/או הפסד נייטרלי (es) כי הם אבחון עבור כיתות שלמות של תרכובות. מגבלה של DFF הוא יונים אופייניים מוצר ו/או הפסדים ניטרליים עבור מחלקה של תרכובות חייב להיות מוגדר על ידי האנליסט.
לדוגמה, כל אחד יותר מ 60 שונים של fumonisin פטרת מזוהה8,9 בעלי שרשרת של tricarballylic אשר יוצר m/z 157.0142 (C6H5O5–) מוצר יון על פיצול של [M-H]– יון4. לכן, כל pumonisins במדגם ניתן לזהות באמצעות DFF על ידי הקרנת כל MS/MS ספקטרום בתוך ערכת נתונים של לוד המכילים את הבולטים m/z 157.0142 המוצר יון. באופן דומה, תרכובות sulfated ניתן להבחין על ידי הקרנת מגדיר הנתונים של דה לטרשת נפוצה/ms המכילים אובדן ניטרלי אבחון של 79.9574 Da (SO3)3. גישה זו גם הוחל בהצלחה לגילוי חדש פפטידים מחזורי5 ומוצרים טבעיים המכילים טריפטופן או שאריות פנילאלטין6.
כדי להדגים את האפקטיביות של DFF ואת קלות השימוש שלה בתוך פלטפורמת MZmine10, החלתי גישה זו לניתוח microcystins (mcs); מחלקה של מעל 240 רעלים הקשורים מבחינה מבנית המיוצר על ידי כחוליות מים מתוקים11,12,13.
מרבית הרעלים שדווחו הם MCs, עם MC-LR (לאוצין [L]/arginine [R]) congener לרוב למדו (איור 1). מחשבי MCs הם מונלוציציתיים שאינם הריבוזומפיים, ביוסינתזה על ידי מספר סייאובקטריה כולל מיקרוצילסטיס, אננינה, Nostoc, ו- plankto,12. מחשבי MCs מורכבים מחמישה שאריות משותפים ושני תנוחות משתנה שנכבשו על ידי חומצות אמינו. כמעט כל MCs בעלי מאפיין β-אמינו חומצה 3-אמינו-9-מתיונין-2, 6, 8-triמתיק-10-פנילdeca-4, 6-חומצה dienoic (Adda) שאריות בעמדה 511. משעולים הפיצול ms/ms של mcs מתוארים היטב14,15; שאריות adda אחראי יון מוצר ms/ms בולטים, m/z 135.0803+ (C9H11O+) כמו גם יוני מוצרים אחרים כולל m/z 163.1114+ (C11H15 O+) (איור 2). לא ממוקד הנתונים של מערכת המידע הנייד של מיקרוצילף שניתן להציג עבור כל microcystins הנמצאים באמצעות יוני אבחון אלה, והעניק כי המיקרוcystins יש שאריות adda.
Protocol
Representative Results
Discussion
DFF היא אסטרטגיה ישר-קדימה ומהירה לזיהוי מחלקות שלמות של תרכובות, רלוונטיות במיוחד עבור גילוי מתחם טבעי מוצר. ההיבט החשוב ביותר של DFF הוא הגדרת קריטריונים ספציפיים MS/MS הפיצול עבור המעמד המיועד של תרכובות. בדוגמה זו, השתמשו ב-DFF כדי לאתר את כל שאריות Adda המכילים מחשבי MCs בתמצית סלולרית של M. aerug…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים הת רושון (מרכז התרבות Phycological הקנדי, אוניברסיטת ווטרלו על מתן התרבות הקיבקקטריה למד וסורסאן אבושרף (אוניברסיטת קרפלטון) לקבלת סיוע טכני.
Materials
| Cyanobacteria | |||
| Microcystis aeruginosaCPCC300 | CANADIAN PHYCOLOGICAL CULTURE CENTRE | CPCC300 | https://uwaterloo.ca/canadian-phycological-culture-centre/ |
| Software | |||
| Proteowizard (software) | software | http://proteowizard.sourceforge.net/ | |
| Mzmine 2 | software | http://mzmine.github.io/ | |
| LC-MS | |||
| Q-Exactive Orbitrap | Thermo | – | Equipped with HESI ionization source |
| 1290 UHPLC | Agilent | Equipped with binary pump, autosampler, column compartment | |
| C18 column | Agilent | 959757-902 | Eclipse Plus C18 RRHD column (2.1 × 100 mm, 1.8 μm) |
| Solvents | |||
| Optima LC-MS grade Methanol | Fisher | A456-4 | |
| OptimaLC-MS grade Acetonitrile | Fisher | A955-4 | |
| OptimaLC-MS grade Water | Fisher | W6-4 | |
| LC-MS grade Formic Acid | Fisher | A11710X1-AMP | |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Centrifuge Sorvall Micro 21 | Thermo Scientific | 75-772-436 | |
| Other | |||
| Amber HPLC vials 2 mL/caps | Agilent | 5182-0716/5182-0717 | |
| 0.2-μm PTFE syringe filters | Pall Corp. | 4521 | |
| Whatman 47mm GF/A glass microfiber filters | Sigma-Aldrich | WHA1820047 | |
| Media | |||
| MA media (pH 8.6) ( quantity / L) | Watanabe, M. F. & Oishi, S. Effects of environmental factors on toxicity of a cyanobacterium (Microcystis aeruginosa) under culture conditions. Applied and Environmental microbiology. 49 (5), 1342-1344 (1985). | ||
| Ca(NO3)·4H2O, 50 mg | Sigma-Aldrich | C2786 | |
| KNO3, 100 mg | Sigma-Aldrich | P8291 | |
| NaNO3, 50 mg | Sigma-Aldrich | S5022 | |
| Na2SO4, 40 mg | Sigma-Aldrich | S5640 | |
| MgCl2·6H20, 50 mg | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Sodium glycerophosphate, 100 mg | Sigma-Aldrich | G9422 | |
| H3BO3, 20 mg | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Bicine, 500 mg | Sigma-Aldrich | RES1151B-B7 | |
| P(IV) metal solution, 5 mL | |||
| Bring the following to 1 L with ddH2O | |||
| NaEDTA·2HO | Sigma-Aldrich | E6635 | |
| FeCl3 ·6H2O | Sigma-Aldrich | 236489 | |
| MnCl2·4H2O | Baker | 2540 | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | Z0152 | |
| CoCl2·6H2O | Sigma-Aldrich | C8661 | |
| Na2MoO4·2H2O | Baker | 3764 | |
| Cyanobacteria BG-11 50X Freshwater Solution | Sigma-Aldrich | C3061-500mL |
References
- Mayer, P. M., Poon, C. The mechanisms of collisional activation of ions in mass spectrometry. Mass Spectrometry Reviews. 28 (4), 608-639 (2009).
- Fisch, K. M. Biosynthesis of natural products by microbial iterative hybrid PKS–NRPS. RSC Advances. 3 (40), 18228-18247 (2013).
- Kelman, M. J., et al. Identification of six new Alternaria sulfoconjugated metabolites by high-resolution neutral loss filtering. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 29 (19), 1805-1810 (2015).
- Renaud, J. B., Kelman, M. J., Qi, T. F., Seifert, K. A., Sumarah, M. W. Product ion filtering with rapid polarity switching for the detection of all fumonisins and AAL-toxins. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 29 (22), 2131-2139 (2015).
- Renaud, J. B., Kelman, M. J., McMullin, D. R., Yeung, K. K. -. C., Sumarah, M. W. Application of C8 liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the analysis of enniatins and bassianolides. Journal of Chromatography A. 1508, 65-72 (2017).
- Walsh, J. P., et al. Diagnostic Fragmentation Filtering for the Discovery of New Chaetoglobosins and Cytochalasins. Rapid Communications in Mass Spectrometry. , (2018).
- Wang, M., et al. Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking. Nature biotechnology. 34 (8), 828 (2016).
- Bartók, T., Szécsi, &. #. 1. 9. 3. ;., Szekeres, A., Mesterházy, &. #. 1. 9. 3. ;., Bartók, M. Detection of new fumonisin mycotoxins and fumonisin-like compounds by reversed-phase high-performance liquid chromatography/electrospray ionization ion trap mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry: An International Journal Devoted to the Rapid Dissemination of Up-to-the-Minute Research in Mass Spectrometry. 20 (16), 2447-2462 (2006).
- Bartók, T., et al. Detection and characterization of twenty-eight isomers of fumonisin B1 (FB1) mycotoxin in a solid rice culture infected with Fusarium verticillioides by reversed-phase high-performance liquid chromatography/electrospray ionization time-of-flight and ion trap mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 24 (1), 35-42 (2010).
- Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Orešič, M. MZmine 2: modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data. BMC bioinformatics. 11 (1), 395 (2010).
- Spoof, L., Catherine, A. Appendix 3: tables of microcystins and nodularins. Handbook of cyanobacterial monitoring and cyanotoxin analysis. , 526-537 (2016).
- Pick, F. R. Blooming algae: a Canadian perspective on the rise of toxic cyanobacteria. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 73 (7), 1149-1158 (2016).
- Carmichael, W. W., Boyer, G. L. Health impacts from cyanobacteria harmful algae blooms: Implications for the North American Great Lakes. Harmful algae. 54, 194-212 (2016).
- Mayumi, T., et al. Structural characterization of microcystins by LC/MS/MS under ion trap conditions. The Journal of antibiotics. 59 (11), 710 (2006).
- Frias, H. V., et al. Use of electrospray tandem mass spectrometry for identification of microcystins during a cyanobacterial bloom event. Biochemical and biophysical research communications. 344 (3), 741-746 (2006).
- Kessner, D., Chambers, M., Burke, R., Agus, D., Mallick, P. ProteoWizard: open source software for rapid proteomics tools development. Bioinformatics. 24 (21), 2534-2536 (2008).
- Watanabe, M. F., Oishi, S. Effects of environmental factors on toxicity of a cyanobacterium (Microcystis aeruginosa) under culture conditions. Applied and Environmental microbiology. 49 (5), 1342-1344 (1985).
- Hollingdale, C., et al. Feasibility study on production of a matrix reference material for cyanobacterial toxins. Analytical and bioanalytical chemistry. 407 (18), 5353-5363 (2015).
- Yuan, M., Namikoshi, M., Otsuki, A., Sivonen, K. Effect of amino acid side-chain on fragmentation of cyclic peptide ions: differences of electrospray ionization/collision-induced decomposition mass spectra of toxic heptapeptide microcystins containing ADMAdda instead of Adda. European Mass Spectrometry. 4 (4), 287-298 (1998).
- Schymanski, E., et al. Identifying small molecules via high resolution mass spectrometry: communicating confidence. Environmental science & technology. 48 (4), 2097 (2014).
