LC-MS/MS 診断フラグメンテーションによる自然な製品の発見: ミクロシスチン分析のためのアプリケーション
Summary
MZmine に実装された診断フラグメンテーションフィルタリングは、既知および未知の天然製品のクラス全体について、LC-MS/MS データセットをスクリーニングするための、エレガントで取得後のアプローチです。このツールは、分析者が化合物クラス全体の診断として定義した製品イオンおよび/または中性損失の MS/MS スペクトルを検索します。
Abstract
天然物は、多くの場合、単一の化合物ではなく、構造的に類似した化合物の混合物として生合成。共通の構造的特徴のために、同じクラス内の多くの化合物は、同様の MS/MS 断片化を受け、いくつかの同一の製品イオンおよび/または中性損失を有する。診断フラグメンテーションフィルタリング (DFF) の目的は、クラス固有の製品イオンおよび/または中性損失を含む MS/MS スペクトルの非ターゲット LC-ms/MS データセットをスクリーニングすることにより、複雑な抽出で特定のクラスのすべての化合物を効率的に検出することです。この方法は、四重極 Orbitrap または四重極のタイムオブフライト質量などの高分解能質量分析計でのデータ依存型集録によって分析されるサンプル抽出を必要とするオープンソース MZmine プラットフォーム内に実装した DFF モジュールに基づいています。アナライザー。このアプローチの主な制限は、アナリストは、天然物の対象となるクラスに固有の製品のイオンおよび/またはニュートラルな損失を最初に定義する必要があります。DFF は、新しい化合物を含む複雑なサンプル内のすべての関連する天然物のその後の発見を可能にします。本研究では、藍藻の原因となるMicrocystis 膿菌の抽出物を、ミクロシスチンの産生に対してスクリーニングすることにより、DFF の有効性を実証する。
Introduction
タンデム質量分析法 (MS/MS) は、前駆体イオンを単離し、衝突誘導解離 (CID) のような活性化エネルギーの適用を介して断片化を誘導することを含む、広く使用されている質量分析方法です。イオンフラグメントがその分子構造と密接に結びついている方法。天然物は、多くの場合、単一のユニークな化学物質2としてではなく、構造的に類似した化合物の混合物として生合成。そのため、同じ生合成クラスの一部である構造的に関連する化合物は、共通の製品イオンおよび/または中性損失を含む重要な MS/MS フラグメンテーション特性を共有することが多い。クラス固有の製品イオンおよび/または中性損失を有する化合物のための複雑なサンプルをスクリーニングする能力は、化合物のクラス全体を検出する強力な戦略であり、潜在的に新しい天然産物の発見につながる3、4,5,6.何十年もの間、低分解能の測定器で実行される中性損失スキャンや前駆体イオンスキャニングなどの質量分析法により、同じ中性損失または製品イオンによるイオンの検出が可能になりました。しかし、実験を行う前に特定のイオンまたは遷移を定義する必要があった。研究室では高分解能の質量分析計が普及しているため、複雑なサンプルは、対象外のデータ依存型集録 (DDA) メソッドを使用して一般的に選別されています。従来の中性損失および前駆体イオン走査とは対照的に、構造的に関連する化合物は、捕捉後分析7によって同定することができる。本研究では、複雑な行列内の化合物の全クラスを検出するための、診断断片化フィルタリング (DFF)5,6と呼ばれる、簡単でわかりやすい方法を開発した戦略を示します。この DFF モジュールは、オープンソースの MZmine 2 プラットフォームに実装されており、MZmine 2.38 またはそれ以降のリリースをダウンロードすることで利用できます。DFF により、ユーザーは、化合物のクラス全体の診断である製品イオン (複数可) および/または中性損失 (es) を含む MS/MS スペクトルの DDA データセットを効率的にスクリーニングすることができます。DFF の制限は、化合物のクラスのための特徴的な製品イオンおよび/または中性損失がアナリストによって定義されなければならない。
例えば、60以上の異なるフモニシンマイコトキシンのそれぞれが8、9が tricarballylic 側鎖を有していることを識別し、その上にm/z 157.0142 (C6H5–5–) 積イオンを発生する[M-H]–イオン4の断片化。したがって、サンプル中のすべての推定 fumonisins は、著名なm/z 157.0142 製品イオンを含む DDA データセット内のすべての MS/ms スペクトルをスクリーニングすることにより、DFF を使用して検出することができます。同様に、硫酸化化合物は、79.9574 Da (SO3)3の診断中立損失を含む ms/MS スペクトルのための DDA データセットをスクリーニングすることによって検出することができる。このアプローチは、新しい環状ペプチド5およびトリプトファンまたはフェニルアラニン残基6を含む天然産物の検出にも首尾よく適用されている。
MZmine プラットフォーム10内での DFF の有効性とその使いやすさを実証するために、ミクロシスチン (MCs) の分析にこのアプローチを適用しました。淡水シアノバクテリア11、12、13によって生成された240以上の構造的に関連する毒素のクラス。
最も一般的に報告されるシアノトキシンは MCs であり、MC-LR (ロイシン [L]/arginine [R]) コンジナー最もよく研究されている (図 1)。MCs は、効果非リボソーム heptapeptides、 Microcystis、アナベナ、ネンジュモ属、およびPlanktothrix12,13を含む複数のシアノバクテリア属によって生合成。MCs は、L-アミノ酸によって占められている5つの共通残基と二つの可変位置からなる。ほぼ全ての Mc は、位置 511に特徴的なβ-アミノ酸 3-アミノ-9-メトキシ-2, 6, 8-トリメチル-10-phenyldeca-4, 6-dienoic 酸 (Adda) 残基を有する。 MCs の ms/ms フラグメンテーション経路はよく説明されています14,15;Adda 残基は、著名な ms/ms 製品イオン、 m/z 135.0803+ (c9H11O+) だけでなく、 m/z 163.1114+ (c11h 15 を含む他の製品のイオンを担当していますO+) (図 2)。Microcystis 膿菌の非標的 DDA データセット細胞抽出物は、これらの診断イオンを使用して存在するすべてのミクロシスチンについてスクリーニングすることができ、ミクロシスチンは Adda 残基を有することが認められる。
Protocol
Representative Results
Discussion
DFF は、化合物のクラス全体を検出するための簡単で迅速な戦略で、特に天然物の化合物の発見に関連しています。DFF の最も重要な側面は、対象となる化合物クラスの特定の MS/MS フラグメンテーションの基準を定義することです。この代表例では、DFF は、 m. 膿菌細胞抽出物中に存在する MCs を含むすべての Adda 残基を検出するために使用した。MCs の大半は Adda 残留物を含んでいるが?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者たちは、Roshon (カナダ林内藻類相文化センター、ウォータールー大学で、研究しているシアノバクテリアの文化を提供し、Sawsan Abusharkh (カールトン大学) の技術支援に感謝した。
Materials
| Cyanobacteria | |||
| Microcystis aeruginosaCPCC300 | CANADIAN PHYCOLOGICAL CULTURE CENTRE | CPCC300 | https://uwaterloo.ca/canadian-phycological-culture-centre/ |
| Software | |||
| Proteowizard (software) | software | http://proteowizard.sourceforge.net/ | |
| Mzmine 2 | software | http://mzmine.github.io/ | |
| LC-MS | |||
| Q-Exactive Orbitrap | Thermo | – | Equipped with HESI ionization source |
| 1290 UHPLC | Agilent | Equipped with binary pump, autosampler, column compartment | |
| C18 column | Agilent | 959757-902 | Eclipse Plus C18 RRHD column (2.1 × 100 mm, 1.8 μm) |
| Solvents | |||
| Optima LC-MS grade Methanol | Fisher | A456-4 | |
| OptimaLC-MS grade Acetonitrile | Fisher | A955-4 | |
| OptimaLC-MS grade Water | Fisher | W6-4 | |
| LC-MS grade Formic Acid | Fisher | A11710X1-AMP | |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Centrifuge Sorvall Micro 21 | Thermo Scientific | 75-772-436 | |
| Other | |||
| Amber HPLC vials 2 mL/caps | Agilent | 5182-0716/5182-0717 | |
| 0.2-μm PTFE syringe filters | Pall Corp. | 4521 | |
| Whatman 47mm GF/A glass microfiber filters | Sigma-Aldrich | WHA1820047 | |
| Media | |||
| MA media (pH 8.6) ( quantity / L) | Watanabe, M. F. & Oishi, S. Effects of environmental factors on toxicity of a cyanobacterium (Microcystis aeruginosa) under culture conditions. Applied and Environmental microbiology. 49 (5), 1342-1344 (1985). | ||
| Ca(NO3)·4H2O, 50 mg | Sigma-Aldrich | C2786 | |
| KNO3, 100 mg | Sigma-Aldrich | P8291 | |
| NaNO3, 50 mg | Sigma-Aldrich | S5022 | |
| Na2SO4, 40 mg | Sigma-Aldrich | S5640 | |
| MgCl2·6H20, 50 mg | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Sodium glycerophosphate, 100 mg | Sigma-Aldrich | G9422 | |
| H3BO3, 20 mg | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Bicine, 500 mg | Sigma-Aldrich | RES1151B-B7 | |
| P(IV) metal solution, 5 mL | |||
| Bring the following to 1 L with ddH2O | |||
| NaEDTA·2HO | Sigma-Aldrich | E6635 | |
| FeCl3 ·6H2O | Sigma-Aldrich | 236489 | |
| MnCl2·4H2O | Baker | 2540 | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | Z0152 | |
| CoCl2·6H2O | Sigma-Aldrich | C8661 | |
| Na2MoO4·2H2O | Baker | 3764 | |
| Cyanobacteria BG-11 50X Freshwater Solution | Sigma-Aldrich | C3061-500mL |
References
- Mayer, P. M., Poon, C. The mechanisms of collisional activation of ions in mass spectrometry. Mass Spectrometry Reviews. 28 (4), 608-639 (2009).
- Fisch, K. M. Biosynthesis of natural products by microbial iterative hybrid PKS–NRPS. RSC Advances. 3 (40), 18228-18247 (2013).
- Kelman, M. J., et al. Identification of six new Alternaria sulfoconjugated metabolites by high-resolution neutral loss filtering. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 29 (19), 1805-1810 (2015).
- Renaud, J. B., Kelman, M. J., Qi, T. F., Seifert, K. A., Sumarah, M. W. Product ion filtering with rapid polarity switching for the detection of all fumonisins and AAL-toxins. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 29 (22), 2131-2139 (2015).
- Renaud, J. B., Kelman, M. J., McMullin, D. R., Yeung, K. K. -. C., Sumarah, M. W. Application of C8 liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the analysis of enniatins and bassianolides. Journal of Chromatography A. 1508, 65-72 (2017).
- Walsh, J. P., et al. Diagnostic Fragmentation Filtering for the Discovery of New Chaetoglobosins and Cytochalasins. Rapid Communications in Mass Spectrometry. , (2018).
- Wang, M., et al. Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking. Nature biotechnology. 34 (8), 828 (2016).
- Bartók, T., Szécsi, &. #. 1. 9. 3. ;., Szekeres, A., Mesterházy, &. #. 1. 9. 3. ;., Bartók, M. Detection of new fumonisin mycotoxins and fumonisin-like compounds by reversed-phase high-performance liquid chromatography/electrospray ionization ion trap mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry: An International Journal Devoted to the Rapid Dissemination of Up-to-the-Minute Research in Mass Spectrometry. 20 (16), 2447-2462 (2006).
- Bartók, T., et al. Detection and characterization of twenty-eight isomers of fumonisin B1 (FB1) mycotoxin in a solid rice culture infected with Fusarium verticillioides by reversed-phase high-performance liquid chromatography/electrospray ionization time-of-flight and ion trap mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 24 (1), 35-42 (2010).
- Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Orešič, M. MZmine 2: modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data. BMC bioinformatics. 11 (1), 395 (2010).
- Spoof, L., Catherine, A. Appendix 3: tables of microcystins and nodularins. Handbook of cyanobacterial monitoring and cyanotoxin analysis. , 526-537 (2016).
- Pick, F. R. Blooming algae: a Canadian perspective on the rise of toxic cyanobacteria. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 73 (7), 1149-1158 (2016).
- Carmichael, W. W., Boyer, G. L. Health impacts from cyanobacteria harmful algae blooms: Implications for the North American Great Lakes. Harmful algae. 54, 194-212 (2016).
- Mayumi, T., et al. Structural characterization of microcystins by LC/MS/MS under ion trap conditions. The Journal of antibiotics. 59 (11), 710 (2006).
- Frias, H. V., et al. Use of electrospray tandem mass spectrometry for identification of microcystins during a cyanobacterial bloom event. Biochemical and biophysical research communications. 344 (3), 741-746 (2006).
- Kessner, D., Chambers, M., Burke, R., Agus, D., Mallick, P. ProteoWizard: open source software for rapid proteomics tools development. Bioinformatics. 24 (21), 2534-2536 (2008).
- Watanabe, M. F., Oishi, S. Effects of environmental factors on toxicity of a cyanobacterium (Microcystis aeruginosa) under culture conditions. Applied and Environmental microbiology. 49 (5), 1342-1344 (1985).
- Hollingdale, C., et al. Feasibility study on production of a matrix reference material for cyanobacterial toxins. Analytical and bioanalytical chemistry. 407 (18), 5353-5363 (2015).
- Yuan, M., Namikoshi, M., Otsuki, A., Sivonen, K. Effect of amino acid side-chain on fragmentation of cyclic peptide ions: differences of electrospray ionization/collision-induced decomposition mass spectra of toxic heptapeptide microcystins containing ADMAdda instead of Adda. European Mass Spectrometry. 4 (4), 287-298 (1998).
- Schymanski, E., et al. Identifying small molecules via high resolution mass spectrometry: communicating confidence. Environmental science & technology. 48 (4), 2097 (2014).
