Descoberta natural do produto com filtração da fragmentação diagnóstica de LC-MS/MS: aplicação para a análise do Microcystin
Summary
Filtragem de fragmentação de diagnóstico, implementada em MZmine, é uma abordagem elegante, pós-aquisição para tela LC-MS/MS conjuntos de dados para classes inteiras de produtos naturais conhecidos e desconhecidos. Esta ferramenta procura espectros MS/MS para íons de produto e/ou perdas neutras que o analista definiu como sendo diagnóstico para toda a classe de compostos.
Abstract
Os produtos naturais são frequentemente biossintetizados como misturas de compostos estruturalmente semelhantes, em vez de um único composto. Devido a suas características estruturais comuns, muitos compostos dentro da mesma classe sofrem a fragmentação similar de MS/MS e têm diversos íons idênticos do produto e/ou perdas neutras. O objetivo da filtragem de fragmentação diagnóstica (DFF) é detectar eficientemente todos os compostos de uma determinada classe em um extrato complexo, selecionando conjuntos de dados não direcionados de LC-MS/MS para espectros MS/MS que contenham íons de produto específicos de classe e/ou perdas neutras. Este método é baseado em um módulo DFF implementado dentro da plataforma MZmine de código aberto que requer extratos de amostra ser analisado por aquisição dependente de dados em um espectrómetro de massa de alta resolução, como Quadrupole Orbitrap ou Quadrupole massa de tempo de vôo Analisadores. A principal limitação desta abordagem é que o analista deve primeiro definir quais íons de produto e/ou perdas neutras são específicos para a classe alvo de produtos naturais. DFF permite a descoberta subseqüente de todos os produtos naturais relacionados dentro de uma amostra complexa, incluindo novos compostos. Neste trabalho, demonstramos a eficácia do DFF através da triagem de extratos de Microcystis aeruginosa, uma flor de algas nocivas proeminente causando cianobactérias, para a produção de microcistinas.
Introduction
A espectrometria de massas em tandem (MS/MS) é um método de espectrometria de massas amplamente utilizado que envolve isolar um íon precursor e induzir a fragmentação via aplicação da energia de ativação, como a dissociação induzida por colisão (CID)1. A forma como os fragmentos de íons estão intimamente ligados à sua estrutura molecular. Os produtos naturais são muitas vezes biossintetizados como misturas de compostos estruturalmente semelhantes, em vez de como um único produto químico único2. Como tal, compostos estruturalmente relacionados que fazem parte da mesma classe biossintética muitas vezes compartilham características-chave de fragmentação MS/MS, incluindo íons de produtos compartilhados e/ou perdas neutras. A capacidade de amostras complexas de tela para compostos que possuem íons de produto de classe específica e/ou perdas neutras é uma estratégia poderosa para detectar classes inteiras de compostos, potencialmente levando à descoberta de novos produtos naturais3, 4. º , 5. º , 6. por décadas, os métodos de espectrometria de massa, como a digitalização de perda neutra e a digitalização de íons precursores realizados em instrumentos de baixa resolução permitiram a detecção de íons com a mesma perda neutra ou íons de produto. No entanto, os íons ou transições específicas precisavam ser definidos antes da realização dos experimentos. Como espectrómetros de massa de alta resolução tornaram-se mais populares em laboratórios de pesquisa, amostras complexas são agora comumente rastreadas usando métodos de aquisição (DDA) não direcionados e dependentes de dados. Em contraste com a perda neutra tradicional e a varredura do íon do precursor, os compostos estruturalmente relacionados podem ser identificados pela análise do borne-aquisição7. Neste trabalho, demonstramos uma estratégia que desenvolvemos denominado filtragem de fragmentação diagnóstica (dff)5,6, uma abordagem direta e fácil de usar para detectar classes inteiras de compostos dentro de matrizes complexas. Este módulo DFF foi implementado na plataforma de código aberto, MZmine 2 e disponível baixando MZmine 2,38 ou lançamentos mais recentes. DFF permite aos usuários a tela eficientemente conjuntos de dados DDA para MS/MS espectros que contêm íons do produto (s) e/ou perda neutra (es) que são diagnósticos para classes inteiras de compostos. Uma limitação de DFF é íons do produto característico e/ou as perdas neutras para uma classe de compostos devem ser definidas pelo analista.
Por exemplo, cada uma das mais de 60 micotoxinas fumonisicas diferentes identificadas8,9possuem uma cadeia lateral tricarballylic, que gera um íon de produto m/z 157, 142 (C6H5O5–) após fragmentação do [M-H]– Ion4. Portanto, todas as fumonisinas putativas em uma amostra podem ser detectadas usando DFF por meio da triagem de todos os espectros MS/MS dentro de um conjunto de dados DDA que contenham o íon de produto m/z 157, 142 proeminente. Da mesma forma, os compostos sulados podem ser detectados pela triagem de conjuntos de dados DDA para espectros MS/MS que contêm uma perda neutra diagnóstica de 79,9574 da (SO3)3. Esta abordagem também foi aplicada com sucesso para a detecção de novos peptídeos cíclicos5 e produtos naturais que contêm resíduos de triptofano ou fenilalanina6.
Para demonstrar a efetividade do DFF e sua facilidade de uso dentro da plataforma MZmine10, aplicamos essa abordagem à análise de microcistinas (MCS); uma classe de mais de 240 toxinas estruturalmente relacionadas produzidas por cianobactérias de água doce11,12,13.
As cianotoxinas mais comumente relatadas são MCs, com o congéner MC-LR (leucina [L]/arginina [R]) mais freqüentemente estudado (Figura 1). MCs são heptapeptides não-ribossômicos monocílicos, biossintetizados por múltiplos gêneros de cianobactérias, incluindo Microcystis, Anabaena, no, e Planktothrix12,13. Os MCs são compostos por cinco resíduos comuns e duas posições variáveis ocupadas por aminoácidos L. Quase todos os MCs possuem um resíduo característico do ácido β-aminoácido 3-amino-9-metoxi-2,6,8-trimetil-10-fenildeca-4,6-dienoico (Adda) na posição 511. As vias de fragmentação MS/MS do MCS são bem descritas14,15; o resíduo de Adda é responsável para o íon proeminente do produto de MS/MS, m/z 135, 803+ (c9H11O+) assim como outros íons do produto que incluem m/z 163,1114+ (C11H15 O+) (Figura 2). Conjuntos de dados de DDA não direcionados de extratos celulares de Microcystis aeruginosa podem ser rastreados para todas as microcistinas presentes usando esses íons diagnósticos, dado que as microcistinas têm um resíduo de Adda.
Protocol
Representative Results
Discussion
DFF é uma estratégia direta e rápida para a detecção de classes inteiras de compostos, especialmente relevantes para a descoberta de compostos de produtos naturais. O aspecto mais importante do DFF é definir os critérios específicos de fragmentação MS/MS para a classe de compostos de destino. Neste exemplo representativo, o DFF foi utilizado para detectar todos os resíduos de Adda contendo MCs presentes em extrato celular M. aeruginosa . Embora a grande maioria dos MCs contenha um resíduo de Adda, ou…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem Heather Roshon (centro de cultura phycological canadense, Universidade de Waterloo para fornecer a cultura do cianobactérias estudada e sawsan abusharkh (Universidade de Carleton) para a assistência técnica.
Materials
| Cyanobacteria | |||
| Microcystis aeruginosaCPCC300 | CANADIAN PHYCOLOGICAL CULTURE CENTRE | CPCC300 | https://uwaterloo.ca/canadian-phycological-culture-centre/ |
| Software | |||
| Proteowizard (software) | software | http://proteowizard.sourceforge.net/ | |
| Mzmine 2 | software | http://mzmine.github.io/ | |
| LC-MS | |||
| Q-Exactive Orbitrap | Thermo | – | Equipped with HESI ionization source |
| 1290 UHPLC | Agilent | Equipped with binary pump, autosampler, column compartment | |
| C18 column | Agilent | 959757-902 | Eclipse Plus C18 RRHD column (2.1 × 100 mm, 1.8 μm) |
| Solvents | |||
| Optima LC-MS grade Methanol | Fisher | A456-4 | |
| OptimaLC-MS grade Acetonitrile | Fisher | A955-4 | |
| OptimaLC-MS grade Water | Fisher | W6-4 | |
| LC-MS grade Formic Acid | Fisher | A11710X1-AMP | |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Centrifuge Sorvall Micro 21 | Thermo Scientific | 75-772-436 | |
| Other | |||
| Amber HPLC vials 2 mL/caps | Agilent | 5182-0716/5182-0717 | |
| 0.2-μm PTFE syringe filters | Pall Corp. | 4521 | |
| Whatman 47mm GF/A glass microfiber filters | Sigma-Aldrich | WHA1820047 | |
| Media | |||
| MA media (pH 8.6) ( quantity / L) | Watanabe, M. F. & Oishi, S. Effects of environmental factors on toxicity of a cyanobacterium (Microcystis aeruginosa) under culture conditions. Applied and Environmental microbiology. 49 (5), 1342-1344 (1985). | ||
| Ca(NO3)·4H2O, 50 mg | Sigma-Aldrich | C2786 | |
| KNO3, 100 mg | Sigma-Aldrich | P8291 | |
| NaNO3, 50 mg | Sigma-Aldrich | S5022 | |
| Na2SO4, 40 mg | Sigma-Aldrich | S5640 | |
| MgCl2·6H20, 50 mg | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Sodium glycerophosphate, 100 mg | Sigma-Aldrich | G9422 | |
| H3BO3, 20 mg | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Bicine, 500 mg | Sigma-Aldrich | RES1151B-B7 | |
| P(IV) metal solution, 5 mL | |||
| Bring the following to 1 L with ddH2O | |||
| NaEDTA·2HO | Sigma-Aldrich | E6635 | |
| FeCl3 ·6H2O | Sigma-Aldrich | 236489 | |
| MnCl2·4H2O | Baker | 2540 | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | Z0152 | |
| CoCl2·6H2O | Sigma-Aldrich | C8661 | |
| Na2MoO4·2H2O | Baker | 3764 | |
| Cyanobacteria BG-11 50X Freshwater Solution | Sigma-Aldrich | C3061-500mL |
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