Method Article

Découverte de produits naturels avec filtrage de fragmentation diagnostique LC-MS/MS: application pour l’analyse microcystine

DOI:

10.3791/59712

⸱

May 31st, 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Carleton University Ottawa, 2London Research and Development Center, Agriculture and Agri-Food Canada

In This Article

Summary

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Le filtrage de fragmentation diagnostique, implémenté dans MZmine, est une approche élégante et post-acquisition pour filtrer les jeux de données LC-MS/MS pour des classes entières de produits naturels connus et inconnus. Cet outil recherche les spectres MS/MS pour les ions produits et/ou les pertes neutres que l’analyste a définies comme étant diagnostiques pour l’ensemble de la classe de composés.

Abstract

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Les produits naturels sont souvent biosynthétisés comme des mélanges de composés structurellement similaires, plutôt qu’un seul composé. En raison de leurs caractéristiques structurelles communes, de nombreux composés au sein de la même classe subissent une fragmentation MS/MS similaire et ont plusieurs ions de produit identiques et/ou des pertes neutres. Le but du filtrage de fragmentation diagnostique (DFF) est de détecter efficacement tous les composés d’une classe donnée dans un extrait complexe en criblant des jeux de données LC-MS/MS non ciblés pour les spectres MS/MS qui contiennent des ions de produit spécifiques à la classe et/ou des pertes neutres. Cette méthode est basée sur un module DFF implémenté dans la plate-forme open-source MZmine qui nécessite l’analyse d’extraits d’échantillons par acquisition dépendante des données sur un spectromètre de masse à haute résolution tel que l’Orbitrap quadrupolaire ou la masse de temps de vol quadrupolaire Analyseurs. La principale limitation de cette approche est l’analyste doit d’abord définir quels ions de produit et/ou pertes neutres sont spécifiques pour la classe ciblée de produits naturels. DFF permet la découverte subséquente de tous les produits naturels connexes dans un échantillon complexe, y compris les nouveaux composés. Dans ce travail, nous démontrons l’efficacité de la DFF en criblant des extraits de Microcystis aeruginosa, une floraison algale nocive importante causant des cyanobactéries, pour la production de microcystines.

Introduction

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La spectrométrie de masse en tandem (MS/MS) est une méthode de spectrométrie de masse largement utilisée qui consiste à isoler union précurseur et à induire la fragmentation par l’application d’énergie d’activation telle que la dissociation induite par collision (CID)1. La manière dont un fragment d’ion est intimement lié à sa structure moléculaire. Les produits naturels sont souvent biosynthétisés comme des mélanges de composés structurellement similaires plutôt que comme un seul produit chimique unique2. En tant que tels, les composés structurellement apparentés qui font partie de la même classe biosynthétique....

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Protocol

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1. préparation des ensembles de données de chromatographie en phase liquide non ciblées (LC)-MS/MS

Remarque: le DFF peut être effectué à l’aide d’un spectromètre de masse à haute résolution et d’une méthode analytique optimisée pour une classe cible d’analytes. Les conditions LC-MS/MS optimisées pour MC sur le spectromètre de masse Orbitrap sont répertoriées dans le tableau des matériaux.

  1. Téléchargement de MZmine 2 (http://mzmine.github.io/)
    Remarque: les exemples de données CPCC300. RAW peuvent être trouvés à https://drive.google.com/open?id=1HHbLdvxCMycSasyNXPRqIe5pkaSqQoS0.
    1. Dans l....

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Results

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Le tracé DFF généré suite à l’analyse de M. aeruginosa CPCC300 est illustré à la figure 4. L’axe xde cette parcelle est le m/z des ions précurseurs qui satisfont aux critères DFF définis tandis que l’axe ymontre le m/z de tous les ions de produit dans les spectres MS/MS MCS. Pour cette analyse, les critères de détection des MC comprenaient des ions précurseurs dans la gamme m/z de 440-1200, des durées de r.......

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Discussion

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DFF est une stratégie directe et rapide pour la détection de classes entières de composés, particulièrement pertinent pour la découverte de composés naturels de produits. L’aspect le plus important de la DFF est de définir les critères spécifiques de fragmentation MS/MS pour la classe ciblée de composés. Dans cet exemple représentatif, le DFF a été utilisé pour détecter tous les résidus d’Adda contenant des MCs présents dans un extrait cellulaire de M. aeruginosa . Bien que la grande majorité des MCs contiennent.......

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Disclosures

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Les auteurs n’ont rien à divulguer

Acknowledgements

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Les auteurs remercient Heather Roshon (Centre canadien de culture phycologique de l’Université de Waterloo pour avoir fourni la culture des cyanobactéries étudiées et sawsan Abusharkh (Université Carleton) pour l’assistance technique.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Cyanobacteria
Microcystis aeruginosaCPCC300CENTRE CANADIEN DE CULTUREhttps://uwaterloo.ca/canadian-phycological-culture-centre/
Software
Proteowizard (software)softwarehttp://proteowizard.sourceforge.net/
Mzmine 2logiciel
http://mzmine.github.io/LC-MS
Q-Exactive OrbitrapThermo-Equipé avec source d’ionisation HESI
1290 UHPLCAgilentEquipé d’une pompe binaire, d’un passeur d’échantillons, d’un compartiment de colonne
ColonneC18Agilent959757-902Eclipse Plus C18 Colonne RRHD (2.1 × ; 100 mm, 1.8 &mu ; m)
forts
Optima LC-MS MéthanolFisherA456-4
OptimaLC-MS grade AcétonitrileFisherA955-4
OptimaLC-MS grade WaterFisherW6-4
LC-MS grade Formic AcidFisherA11710X1-AMP
Vortex-Genie 2Scientific IndustriesSI-0236
Centrifugeuse Sorvall Micro 21Thermo Scientific75-772-436<
strong>Other
Amber Flacons HPLC 2 mL/bouchonsAgilent5182-0716/5182-0717
0.2-&mu ; m Filtres à seringue en PTFEPall Corp.4521
Filtres en microfibre de verre Whatman 47mm GF/ASigma-AldrichWHA1820047
Media
MA media (pH 8.6) ( quantité / L)Watanabe, M. F. & Oishi, S. Effets des facteurs environnementaux sur la toxicité d’une cyanobactérie (Microcystis aeruginosa) dans des conditions de culture. Microbiologie appliquée et environnementale. 49 (5), 1342 à 1344 (1985).
Ca(NO3)· ; 4H2O, 50 mgSigma-AldrichC2786
KNO3, 100 mgSigma-AldrichP8291
NaNO3, 50 mgSigma-AldrichS5022
Na2SO4, 40 mgSigma-AldrichS5640
MgCl2· ; 6H20, 50 mgSigma-AldrichM2393
Glycérophosphate de sodium, 100 mgSigma-AldrichG9422
H3BO3, 20 mgSigma-AldrichB6768
Bicine, 500 mgSigma-AldrichRES1151B-B7
P(IV) solution métallique, 5 mL
Porter les éléments suivants à 1 L avec ddH2O
NaEDTA· ; 2HOSigma-AldrichE6635
FeCl3 · ; 6H2OSigma-Aldrich236489
MnCl2· ; 4H2OBaker2540
ZnCl2Sigma-AldrichZ0152
CoCl2· ; 6H2OSigma-AldrichC8661
Na2MoO4· ; 2H2OBaker3764
Cyanobacteria BG-11 50X Solution d’eau douceSigma-AldrichC3061-500mL
CPCC300

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mayer, P. M., Poon, C. The mechanisms of collisional activation of ions in mass spectrometry. Mass Spectrometry Reviews. 28 (4), 608-639 (2009).
  2. Fisch, K. M. Biosynthesis of natural products by microbial iterative hybrid PKS–NRPS. RSC Advances....

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Diagnostic Fragmentation FilteringMicrocystin AnalysisLC MS MSMZmine SoftwareData Dependent AcquisitionHigh Resolution Mass SpectrometryProduct IonsNeutral LossesMicrocystis aeruginosaNatural Product Discovery

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