Vi presenterer en protokoll ved hjelp av en frem genetisk tilnærming til skjermen for mutanter stiller neurodegeneration i Drosophila melanogaster. Det inkorporerer en klatring analysen, histologi analyse, gen kartlegging og DNA-sekvensering til slutt identifisere romanen gener knyttet til prosessen med neuroprotection.
Det er mye å forstå om utbruddet og progresjon av nevrodegenerative sykdommer, inkludert underliggende gener ansvarlig. Forward genetisk screening ved hjelp av kjemiske mutagener er en nyttig strategi for kartlegging mutant fenotyper til gener blant Drosophila og andre modell organismer som deler bevarte cellulære veier med mennesker. Hvis mutert genet av interesse er ikke dødelig i tidlige utviklingsmessige stadier av fluer, en klatring analysen kan gjennomføres på skjermen for fenotypiske indikatorer på redusert hjernefunksjon, for eksempel lav klatring priser. Deretter kan sekundær histologiske analyse av hjernevevet utføres for å verifisere nervecellene funksjon av genet ved scoring neurodegeneration fenotyper. Gene kartlegging strategier inkluderer meiotic og mangel kartlegging som er avhengige av de samme analysene kan etterfølges av DNA-sekvensering for å identifisere mulige nukleotid endringer i genet av interesse.
Neurons er for det meste post-mitotisk og ute av stand til å dele1,2. I de fleste dyr, nervecellene mekanismer eksisterer for å opprettholde disse cellene i hele organismen levetid, spesielt i alderdommen når neurons er mest sårbare for skader. Gener underliggende disse mekanismene kan identifiseres i mutanter viser neurodegeneration, en fenotypiske indikator for tap av neuroprotection, ved hjelp av en frem genetisk protokoll. Videresende genetisk skjermene benytter kjemikalie mutagener som etanol methanesulfonate (EMS) eller N-etanol-N-nitrosourea (ENU) er spesielt nyttig på grunn av det tilfeldig punkt mutasjoner de indusere, resulterer inne en iboende upartisk adgang det har kaste lyset opp på tallrike gen funksjoner i eukaryote modell organismer3,4,5 (i kontrast, X-ray mutagenese skaper DNA-pauser og kan resultere i omorganisering snarere enn punkt mutasjoner6).
Den vanlige frukten fly Drosophila melanogaster er et ideelt emne for disse skjermene på grunn av sin høye kvalitet, godt kommentert Genova sekvens, sin lange historie som modell organisme med høyt utviklede genetiske verktøy, og mest betydelig, den delte evolusjonær historie med mennesker7,8. En begrensende faktor i anvendelsen av denne protokollen er tidlig dødelighet forårsaket av muterte gener, som ville hindre testing på gamle9år. Men for ikke-dødelige mutasjoner, en klatring analysen, som utnytter negative geotaxis, er en enkel, men omfattende, metode for kvantifisere nedsatt motorfunksjon10. Å vise tilstrekkelig Locomotor reaktivitet, fluer er avhengig av nevrale funksjoner for å bestemme retning, føle sin posisjon, og koordinere bevegelse. Manglende evne til fluer til tilstrekkelig stigning som følge av stimuli kan derfor indikere nevrologiske defekter11. Når en bestemt defekt klatring fenotype er identifisert, ytterligere testing ved hjelp av en sekundær skjerm som histologiske analyse av hjernevevet, kan brukes til å identifisere neurodegeneration i klatring-defekte fluer. Senere gen kartlegging kan deretter brukes til å avdekke den genomisk regionen på kromosom som bærer det defekte nervecellene genet av interesse. For å innskrenke den kromosom regionen av interesse, meiotic kartlegging ved hjelp av mutant fly linjer bærer dominerende markør gener med kjente steder på kromosom kan utføres. Markør gener fungerer som et referansepunkt for mutasjon som frekvensen av rekombinasjon mellom to Loci gir en målbar avstand som kan brukes til å kartlegge omtrentlig plassering av et gen. Til slutt, krysser de muterte linjene med linjer som frakter balanserte mangler på meiotically kartlagt kromosom regionen av interesse, skaper en komplementering test der genet av interesse kan verifiseres hvis dens kjente fenotype uttrykkes5. Polymorfe nukleotid sekvenser i identifiserte genet, muligens resulterer i en endret aminosyre sekvenser, kan evalueres ved sekvensering genet og sammenligne den med Drosophila Genova sekvensen. Senere karakterisering av genet av interesse kan inkludere testing av ytterligere mutant alleler, mutasjon redning eksperimenter og undersøkelse av ytterligere fenotyper.
Forward genetiske skjermer i Drosophila har vært en effektiv tilnærming for å identifisere gener involvert i ulike biologiske prosesser, inkludert alder-avhengige neuroprotection5,23,24, 25. ved hjelp av denne strategien, var vi lykkes i å identifisere ungen som en roman nervecellene genet17.
Et kritisk trinn i denne prot…
The authors have nothing to disclose.
Vi er spesielt takknemlige for Dr. Barry Ganetzky, i Who ‘ s Lab den genetiske skjermen ble utført, slik at identifisering og karakterisering av ungen som en nervecellene genet. Vi takker Dr. Steven Robinow for vennlig å gi samlingen av ENU-mutagenized fluer brukes i den genetiske skjermen presentert i denne artikkelen. Vi takker medlemmene av Ganetzky Lab, DRS. Grace Boekhoff-Falk og David Wassarman for nyttige diskusjoner gjennom hele prosjektets varighet, Ling Ling Ho og Bob Kreber for teknisk assistanse, Dr. Aki Ikeda for bruk av hans mikrotomen anlegget på University of Wisconsin og Dr. Kim Lackey og den optiske analyse Facility ved University of Alabama.
Major equipment | |||
Fume hood for histology | |||
Light Microscope | Nikon | Eclipe E100 | Preferred objective for imaging is X20 |
Imaging software | Nikon | ||
Microscope Camera | Nikon | ||
Thermal cycler | Eppendorf | ||
Fly pushing and climbing assay | |||
VWR® Drosophila Vial, Narrow | VWR | 75813-160 | |
VWR® General-Purpose Laboratory Labeling Tape | VWR | 89097-912 | |
Standard mouse pad | |||
Stereoscope | Motic | Model SMZ-168 | |
CO2 anesthesia station (Blowgun, foot valve, Ultimate Flypad) | Genesee Scientific | 54-104, 59-121, 59-172 | Doesn’t iinclude CO2 tank |
Fine-Tip Brushes | SOLO HORTON BRUSHES, INC. | ||
Drosophila Incubator | VWR | 89510-750 | |
Gene mapping | |||
CantonS | Bloomington Drosophila Stock Center | 9517 | |
w1118 | Bloomington Drosophila Stock Center | 5905 | |
yw | Bloomington Drosophila Stock Center | 6599 | |
Drosophila line used for recombination mapping | Bloomington Drosophila Stock Center | 3227 | Genotype: wg[Sp-1] J[1] L[2] Pin[1]/CyO, P{ry[+t7.2]=ftz/lacB}E3 |
CyO/sno[Sco] | Bloomington Drosophila Stock Center | 2555 | Drosophila balancer line used for recombination mapping |
Deficiency Kit for chromosome 2L | Bloomington Drosophila Stock Center | DK2L | Cook et al., 2012 |
Histology analysis | |||
Ethanol, (100%) | Thermo Fischer Scientific | A4094 | |
Chloroform | Thermo Fischer Scientific | C298-500 | |
Glacial Acetic Acid | Thermo Fischer Scientific | A38-500 | |
Fisherbrand™ Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL | Thermo Fischer Scientific | 05-408-129 | |
Histochoice clearing agent 1X | VWR Life Sciences | 97060-934 | |
Harris Hematoxylin | VWR | 95057-858 | |
Eosin | VWR | 95057-848 | |
Thermo Scientific™ Richard-Allan Scientific™ Mounting Medium | Thermo Scientific™ 4112 | 22-110-610 | CyO/sna[Sco] |
Unifrost Poly-L-Lysine microscope slides, 75x25x1mm, EverMark Select Plus | Azer Scientific | ||
Fisherbrand™ Cover Glasses: Rectangles | Fisherbrand | 12-545M | Dimensions: 24×60 mm |
Traceable timer | VWR | ||
Slide Warmer | Barnstead International | model no. 26025 | |
Slide tray and racks | DWK Life Sciences | Rack to hold 20 slides | |
Fisherbrand™ General-Purpose Extra-Long Forceps | Fisherbrand | 10-316A | |
Kimwipes™ | Kimberly-Clark™ Professional | ||
6 inch Puritan applicators | Hardwood Products Company, Guilford, Maine | 807-12 | |
VWR® Razor Blades | VWR | 55411-050 | |
Tupperware or glass containers for histology liquids | 16 + 1 for running water | ||
High Profile Coated Microtome Blades | VWR | 95057-834 | |
Corning™ Round Ice Bucket with Lid, 4L | Corning™ | ||
Beaker | Or other container for ice water and cassettes | ||
Tissue Bath | Precision Scientific Company | 66630 | |
Microtome | Leica Biosystems | ||
Molecular analysis | |||
Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9282 | |
Ex Taq DNA polymerase | TaKaRa | 5 U/μl | |
Invitrogen™ SYBR™ Safe™ DNA Gel Stain | Invitrogen™ | ||
UltraPure™ Agarose | Invitrogen™ | ||
1 Kb Plus DNA Ladder | Invitrogen™ | ||
ApE-A plasmid Editor software | Available for free download | ||
Statistical analysis | |||
R software package | |||
Further analysis | |||
y[1] w[*]; wg[Sp-1]/CyO; Dr[1]/TM3, Sb[1] | Bloomington Drosophila Stock Center | 59967 |