В Vivo Вперед генетический экран для выявления новых нейропротекторных генов в Drosophila меланогастер
Summary
Мы представляем протокол с использованием передового генетического подхода к экрану для мутантов, демонстрирующих нейродегенерацию в Drosophila melanogaster. Она включает в себя альпинизм анализ, гистологический анализ, генотирование и секвенирование ДНК, чтобы в конечном итоге определить новые гены, связанные с процессом нейрозащиты.
Abstract
Существует много понять о начале и прогрессирования нейродегенеративных заболеваний, в том числе основных генов, ответственных. Вперед генетического скрининга с использованием химических мутагенов является полезной стратегией для отображения мутантных фенотипов к генам среди drosophila и других модельных организмов, которые разделяют сохраненные клеточные пути с людьми. Если мутировавший ген интереса не летальный в предыдущих этапах развития мух, то восхождение исследование можно дирижировать для того чтобы экранировать для фенотипических индикаторов уменьшенного функционирования мозга, such as низкие тарифы взбираясь. Впоследствии, вторичный гистологический анализ ткани мозга может быть выполнен для того, чтобы проверить нейропротекторную функцию гена, забив фенотипов нейродегенерации. Стратегии картирования генов включают мейотическое и дефицитное картирование, которые полагаются на эти же ассеифы, могут сопровождаться секвенированием ДНК для выявления возможных нуклеотидных изменений в интересуемом гене.
Introduction
Нейроны по большей части пост-митотические и не способны разделить1,2. У большинства животных существуют нейропротекторные механизмы для поддержания этих клеток на протяжении всей жизни организма, особенно в пожилом возрасте, когда нейроны наиболее уязвимы к повреждениям. Гены, лежащие в основе этих механизмов, могут быть идентифицированы в мутантах, демонстрирующих нейродегенерацию, фенотипический индикатор потери нейропротекторной защиты, используя вперед генетический протокол. Вперед генетические экраны с использованием химических мутагенов, таких как этил метанесульфонат (EMS) или N-этил-N-нитросурея (ENU) особенно полезны из-за случайных мутаций точки они вызывают, в результате чего по своей сути беспристрастный подход, который пролил свет на многочисленные функции генов вэукариотических модельных организмах 3,4,5 (в отличие от рентгеновского мутагенеза создает разрывы ДНК и могут привести к перестановкам, а не точечным мутациям6).
Обычная плодовая муха Drosophila melanogaster является идеальным предметом для этих экранов из-за его высокого качества, хорошо аннотированной последовательности генома, его долгой истории в качестве модельного организма с высокоразвитыми генетическими инструментами, и, самое главное, его общей эволюционная история с людьми7,8. Ограничивающим фактором применимости этого протокола является ранняя летальность, вызванная мутировавшими генами, что предотвратило бы тестирование в пожилом возрасте9. Однако, для нелетальных мутаций, альпинистский анализ, который использует негативные геотаксиса, является простым, хотя и обширным, методом количественной оценки нарушения функционирования двигателя10. Чтобы продемонстрировать достаточную реакционную реакцию локомотора, мухи зависят от нервных функций, чтобы определить направление, почувствовать его положение и координировать движение. Неспособность мух достаточно подняться в ответ на раздражители может поэтому указать неврологические дефекты11. После того, как конкретный дефектный альпинистский фенотип выявлен, дальнейшее тестирование с использованием вторичного экрана, такого как гистологический анализ тканей мозга, может быть использовано для выявления нейродегенерации у альпинистских мух. Последующее картирование генов может быть использовано для выявления геномной области на хромосоме, несущей дефектный нейропротекторный ген, представляющий интерес. Чтобы сузить хромосомную область, представляющих интерес, может быть выполнено мейотическое картирование с использованием линий мухмутов, несущих доминирующие маркерные гены с известными местами на хромосоме. Гены маркеров служат отправной точкой для мутации, так как частота рекомбинации между двумя локусами обеспечивает измеримое расстояние, которое может быть использовано для картирования приблизительного местоположения гена. Наконец, пересечение линий мутантов с линиями, несущими сбалансированные недостатки на мейотически отображенной хромосомной области интереса создает дополнение тест, в котором ген интереса может быть проверен, если его известный фенотип выражен5. Полиморфные нуклеотидные последовательности в идентифицированном гене, возможно, в результате изменения аминокислотных последовательностей, могут быть оценены путем секвенирования гена и сравнения его с последовательностью генома дрозофилы. Последующая характеристика интересуемого гена может включать тестирование дополнительных мутантных аллелей, эксперименты по спасению мутаций и изучение дополнительных фенотипов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Вперед генетические экраны в Drosophila были эффективным подходом для выявления генов, участвующих в различных биологических процессов, в том числе возрастной нейропротекции5,23,24, 25. Используя эту стратегию, мы были ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы особенно признательны доктору Барри Ганецки, в лаборатории которого был проведен генетический экран, что позволило идентифицировать и охарактеризовать мальчишку как нейропротекторный ген. Мы благодарим д-ра Стивена Робиноу за любезное предоставление коллекции энагенизированных мух, используемых в генетическом экране, представленном в этой статье. Мы благодарим членов лаборатории Ганецки, д-ра Грейс Боехофф-Фалк и Дэвида Вассармана за полезные обсуждения на протяжении всего проекта, Линг Линг Хо и Боба Кребера за техническую помощь, д-ра Аки Икеды за использование его микротомного объекта в Университет Висконсина и д-р Ким Lackey и оптический анализ фонда в Университете штата Алабама.
Materials
| Major equipment | |||
| Fume hood for histology | |||
| Light Microscope | Nikon | Eclipe E100 | Preferred objective for imaging is X20 |
| Imaging software | Nikon | ||
| Microscope Camera | Nikon | ||
| Thermal cycler | Eppendorf | ||
| Fly pushing and climbing assay | |||
| VWR® Drosophila Vial, Narrow | VWR | 75813-160 | |
| VWR® General-Purpose Laboratory Labeling Tape | VWR | 89097-912 | |
| Standard mouse pad | |||
| Stereoscope | Motic | Model SMZ-168 | |
| CO2 anesthesia station (Blowgun, foot valve, Ultimate Flypad) | Genesee Scientific | 54-104, 59-121, 59-172 | Doesn’t iinclude CO2 tank |
| Fine-Tip Brushes | SOLO HORTON BRUSHES, INC. | ||
| Drosophila Incubator | VWR | 89510-750 | |
| Gene mapping | |||
| CantonS | Bloomington Drosophila Stock Center | 9517 | |
| w1118 | Bloomington Drosophila Stock Center | 5905 | |
| yw | Bloomington Drosophila Stock Center | 6599 | |
| Drosophila line used for recombination mapping | Bloomington Drosophila Stock Center | 3227 | Genotype: wg[Sp-1] J[1] L[2] Pin[1]/CyO, P{ry[+t7.2]=ftz/lacB}E3 |
| CyO/sno[Sco] | Bloomington Drosophila Stock Center | 2555 | Drosophila balancer line used for recombination mapping |
| Deficiency Kit for chromosome 2L | Bloomington Drosophila Stock Center | DK2L | Cook et al., 2012 |
| Histology analysis | |||
| Ethanol, (100%) | Thermo Fischer Scientific | A4094 | |
| Chloroform | Thermo Fischer Scientific | C298-500 | |
| Glacial Acetic Acid | Thermo Fischer Scientific | A38-500 | |
| Fisherbrand™ Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL | Thermo Fischer Scientific | 05-408-129 | |
| Histochoice clearing agent 1X | VWR Life Sciences | 97060-934 | |
| Harris Hematoxylin | VWR | 95057-858 | |
| Eosin | VWR | 95057-848 | |
| Thermo Scientific™ Richard-Allan Scientific™ Mounting Medium | Thermo Scientific™ 4112 | 22-110-610 | CyO/sna[Sco] |
| Unifrost Poly-L-Lysine microscope slides, 75x25x1mm, EverMark Select Plus | Azer Scientific | ||
| Fisherbrand™ Cover Glasses: Rectangles | Fisherbrand | 12-545M | Dimensions: 24×60 mm |
| Traceable timer | VWR | ||
| Slide Warmer | Barnstead International | model no. 26025 | |
| Slide tray and racks | DWK Life Sciences | Rack to hold 20 slides | |
| Fisherbrand™ General-Purpose Extra-Long Forceps | Fisherbrand | 10-316A | |
| Kimwipes™ | Kimberly-Clark™ Professional | ||
| 6 inch Puritan applicators | Hardwood Products Company, Guilford, Maine | 807-12 | |
| VWR® Razor Blades | VWR | 55411-050 | |
| Tupperware or glass containers for histology liquids | 16 + 1 for running water | ||
| High Profile Coated Microtome Blades | VWR | 95057-834 | |
| Corning™ Round Ice Bucket with Lid, 4L | Corning™ | ||
| Beaker | Or other container for ice water and cassettes | ||
| Tissue Bath | Precision Scientific Company | 66630 | |
| Microtome | Leica Biosystems | ||
| Molecular analysis | |||
| Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9282 | |
| Ex Taq DNA polymerase | TaKaRa | 5 U/μl | |
| Invitrogen™ SYBR™ Safe™ DNA Gel Stain | Invitrogen™ | ||
| UltraPure™ Agarose | Invitrogen™ | ||
| 1 Kb Plus DNA Ladder | Invitrogen™ | ||
| ApE-A plasmid Editor software | Available for free download | ||
| Statistical analysis | |||
| R software package | |||
| Further analysis | |||
| y[1] w[*]; wg[Sp-1]/CyO; Dr[1]/TM3, Sb[1] | Bloomington Drosophila Stock Center | 59967 | |
References
- Frade, J. M., Ovejero-Benito, M. C. Neuronal cell cycle: the neuron itself and its circumstances. Cell Cycle. 14 (5), 712-720 (2015).
- Aranda-Anzaldo, A. The post-mitotic state in neurons correlates with a stable nuclear higher-order structure. Communicative & Integrative Biology. 5 (2), 134-139 (2012).
- Haelterman, N. A., et al. Large-scale identification of chemically induced mutations in Drosophila melanogaster. Genome Res. 24 (10), 1707-1718 (2014).
- Moresco, E. M., Li, X., Beutler, B. Going forward with genetics: recent technological advances and forward genetics in mice. The American Journal of Pathology. 182 (5), 1462-1473 (2013).
- St Johnston, D. The art and design of genetic screens: Drosophila melanogaster. Nature Reviews Genetics. 3 (3), 176-188 (2002).
- Greenspan, R. J. . Fly pushing: The theory and practice of Drosophila genetics. , (2004).
- Reiter, L. T., Potocki, L., Chien, S., Gribskov, M., Bier, E. A systematic analysis of human disease-associated gene sequences in Drosophila melanogaster. Genome Research. 11 (6), 1114-1125 (2001).
- Rubin, G. M., et al. Comparative genomics of the eukaryotes. Science. 287 (5461), 2204-2215 (2000).
- Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. Journal of Visualized Experiments. (61), (2012).
- Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration. Journal of Visualized Experiments. (49), (2011).
- Karres, J. S., Hilgers, V., Carrera, I., Treisman, J., Cohen, S. M. The conserved microRNA miR-8 tunes atrophin levels to prevent neurodegeneration in Drosophila. Cell. 131 (1), 136-145 (2007).
- Helfrich, C., Engelmann, W. Circadian-Rhythm of the Locomotor-Activity in Drosophila-Melanogaster and Its Mutants Sine Oculis and Small Optic Lobes. Physiological Entomology. 8 (3), 257-272 (1983).
- R Development Core Team. . R: A language and environment for statistical computing. , (2008).
- Bokel, C. EMS screens : from mutagenesis to screening and mapping. Methods in Molecular Bioogyl. 420, 119-138 (2008).
- Lindsley, D. L., Zimm, G. G. . The Genome of Drosophila Melanogaster. , (1992).
- Cook, R. K., et al. The generation of chromosomal deletions to provide extensive coverage and subdivision of the Drosophila melanogaster genome. Genome Biology. 13 (3), R21 (2012).
- Loewen, C., Boekhoff-Falk, G., Ganetzky, B., Chtarbanova, S. A Novel Mutation in Brain Tumor Causes Both Neural Over-Proliferation and Neurodegeneration in Adult Drosophila. Genes Genomes Genetics G3 (Bethesda). 8 (10), 3331-3346 (2018).
- Gloor, G. B., et al. Type I repressors of P element mobility. Génétique. 135 (1), 81-95 (1993).
- Komori, H., Xiao, Q., McCartney, B. M., Lee, C. Y. Brain tumor specifies intermediate progenitor cell identity by attenuating beta-catenin/Armadillo activity. Development. 141 (1), 51-62 (2014).
- Kretzschmar, D., Hasan, G., Sharma, S., Heisenberg, M., Benzer, S. The swiss cheese mutant causes glial hyperwrapping and brain degeneration in Drosophila. The Journal of Neuroscience. 17 (19), 7425-7432 (1997).
- Kang, K. H., Reichert, H. Control of neural stem cell self-renewal and differentiation in Drosophila. Cell and Tissue Research. 359 (1), 33-45 (2015).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted Gene-Expression as a Means of Altering Cell Fates and Generating Dominant Phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Loewen, C. A., Ganetzky, B. Mito-Nuclear Interactions Affecting Lifespan and Neurodegeneration in a Drosophila Model of Leigh Syndrome. Génétique. 208 (4), 1535-1552 (2018).
- Cao, Y., Chtarbanova, S., Petersen, A. J., Ganetzky, B. Dnr1 mutations cause neurodegeneration in Drosophila by activating the innate immune response in the brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (19), E1752-E1760 (2013).
- Lessing, D., Bonini, N. M. Maintaining the brain: insight into human neurodegeneration from Drosophila melanogaster mutants. Nature Reviews Genetics. 10 (6), 359-370 (2009).
- Peng, F., et al. Loss of Polo ameliorates APP-induced Alzheimer’s disease-like symptoms in Drosophila. Scientific Reports. 5, 16816 (2015).
- Venken, K. J., Bellen, H. J. Chemical mutagens, transposons, and transgenes to interrogate gene function in Drosophila melanogaster. Methods. 68 (1), 15-28 (2014).
- Gonzalez, M. A., et al. Whole Genome Sequencing and a New Bioinformatics Platform Allow for Rapid Gene Identification in D. melanogaster EMS Screens. Biology (Basel). 1 (3), 766-777 (2012).
- Palladino, M. J., Hadley, T. J., Ganetzky, B. Temperature-sensitive paralytic mutants are enriched for those causing neurodegeneration in drosophila. Génétique. 161 (3), 1197-1208 (2002).
