In vivo framåt genetisk skärm för att identifiera nya neuroprotektiva gener i Drosophila melanogaster
Summary
Vi presenterar ett protokoll med ett framåtriktat genetiskt förhållningssätt till Screen för mutanter som uppvisar neurodegeneration i Drosophila melanogaster. Den innehåller ett klättrings test, histologisk analys, Genkartläggning och DNA-sekvensering för att slutligen identifiera nya gener relaterade till processen för neuroskydd.
Abstract
Det finns mycket att förstå om uppkomsten och utvecklingen av neurodegenerativa sjukdomar, inklusive de bakomliggande gener som är ansvariga. Framåtriktad genetisk screening med hjälp av kemiska mutagena ämnen är en användbar strategi för att kartlägga muterade fenotyper till gener bland Drosophila och andra modellorganismer som delar bevarade cellulära vägar med människor. Om den muterade genen av intresse inte är dödlig i tidiga utvecklingsstadier av flugor, kan en klätter analys utföras för att skärmen för fenotypiska indikatorer för minskad hjärnans funktion, såsom låg klättring priser. Därefter, sekundär histologisk analys av hjärnvävnad kan utföras för att kontrollera neuroprotektiva funktionen av genen genom att poänggöra neurodegeneration fenotyper. Gen kartläggnings strategier inkluderar meiotiska metafaserna och brist kartläggning som förlitar sig på dessa samma analyser kan följas av DNA-sekvensering för att identifiera möjliga nukleotidförändringar i genen av intresse.
Introduction
Nervceller är till största delen post-mitotiska och oförmögna att dividera1,2. I de flesta djur, neuroprotektiva mekanismer finns för att bibehålla dessa celler hela organismens livslängd, särskilt vid ålderdom när neuroner är mest sårbara för skador. Gener som ligger bakom dessa mekanismer kan identifieras i mutanter som uppvisar neurodegeneration, en fenotypisk indikator för förlust av neuroskydd, med hjälp av ett framåtriktat genetiskt protokoll. Framåt genetiska skärmar med hjälp av kemiska mutagena ämnen såsom etylmetanesulfonat (EMS) eller N-etyl-N-nitrosourea (ENU) är särskilt användbara på grund av de slumpmässiga punktmutationer de inducerar, vilket resulterar i en inneboende opartisk metod som har belysa många gen funktioner i eukaryotiska modellorganismer3,4,5 (i motsats till detta skapar röntgenmuta Genes DNA-avbrott och kan resultera i omordning snarare än punktmutationer6).
Den gemensamma fruktfluga Drosophila melanogaster är ett idealiskt ämne för dessa skärmar på grund av dess höga kvalitet, väl kommenterade genomsekvens, dess långa historia som en modellorganism med högt utvecklade genetiska verktyg, och mest signifikant, dess delade evolutions-historia med människor7,8. En begränsande faktor för tillämpligheten av detta protokoll är tidig dödlighet orsakad av muterade gener, vilket skulle förhindra tester vid ålderdom9. Men för icke-dödliga mutationer, en klätter analys, som utnyttjar negativa geotaxis, är en enkel, även om omfattande, metod för att kvantifiera nedsatt motoriska funktion10. Att uppvisa tillräcklig rörelse reaktivitet, flugor beror på neurala funktioner för att bestämma riktning, känsla dess position, och samordna rörelse. Oförmåga flugor att tillräckligt klättra som svar på stimuli kan därför tyda på neurologiska defekter11. När en viss defekt klättring fenotyp identifieras, ytterligare tester med hjälp av en sekundär skärm som histologisk analys av hjärnvävnad, kan användas för att identifiera neurodegeneration i klättring-defekta flugor. Efterföljande gen mappning kan sedan användas för att avslöja genomisk regionen på kromosomen som transporterar den defekta neuroprotektiva genen av intresse. För att begränsa den kromosomala regionen av intresse, meiotiska metafaserna kartläggning med muterade fluglinor redovisade dominerande markörgener med kända platser på kromosom kan utföras. Markörgener fungerar som en referenspunkt för mutationen eftersom frekvensen av rekombination mellan två loci ger ett mätbart avstånd som kan användas för att kartlägga den ungefärliga placeringen av en gen. Slutligen, korsar muterade linjer med linjer redovisade balanserade brister på meiotically kartlagda kromosomala regionen av intresse skapar ett komplement test där genen av intresse kan verifieras om dess kända fenotyp uttrycks5. Polymorfa nukleotidsekvenser i den identifierade genen, möjligen resulterar i en förändrad aminosyresekvenser, kan utvärderas genom sekvensering av genen och jämföra den med Drosophila genomsekvensen. Efterföljande karakterisering av genen av intresse kan innefatta testning av ytterligare Mutant alleler, Mutations räddning experiment och undersökning av ytterligare fenotyper.
Protocol
Representative Results
Discussion
Framåtriktade genetiska skärmar i Drosophila har varit ett effektivt sätt att identifiera gener som är involverade i olika biologiska processer, inklusive åldersberoende neuroprotektion5,23,24, 25. med hjälp av denna strategi, vi lyckades identifiera Brat som en roman neuroprotektiva genen17.
Ett kritiskt steg i detta p…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi är särskilt tacksamma för Dr Barry Ganetzky, i WHO ‘ s Lab den genetiska skärmen utfördes, vilket möjliggör identifiering och karakterisering av Brat som en nervskyddande gen. Vi tackar Dr Steven Robinow för vänligt tillhandahålla insamling av ENU-mutagenized flugor som används i den genetiska skärmen som presenteras i denna artikel. Vi tackar medlemmarna i ganetzky Lab, DRS. Grace Boekhoff-Falk och David wassarman för hjälpsamma diskussioner under hela varaktigheten av detta projekt, Ling Ling Ho och Bob kreber för tekniskt stöd, Dr Aki Ikeda för användning av hans mikrotomen anläggning vid University of Wisconsin och Dr. Kim Lackey och den optiska analys anläggningen vid University of Alabama.
Materials
| Major equipment | |||
| Fume hood for histology | |||
| Light Microscope | Nikon | Eclipe E100 | Preferred objective for imaging is X20 |
| Imaging software | Nikon | ||
| Microscope Camera | Nikon | ||
| Thermal cycler | Eppendorf | ||
| Fly pushing and climbing assay | |||
| VWR® Drosophila Vial, Narrow | VWR | 75813-160 | |
| VWR® General-Purpose Laboratory Labeling Tape | VWR | 89097-912 | |
| Standard mouse pad | |||
| Stereoscope | Motic | Model SMZ-168 | |
| CO2 anesthesia station (Blowgun, foot valve, Ultimate Flypad) | Genesee Scientific | 54-104, 59-121, 59-172 | Doesn’t iinclude CO2 tank |
| Fine-Tip Brushes | SOLO HORTON BRUSHES, INC. | ||
| Drosophila Incubator | VWR | 89510-750 | |
| Gene mapping | |||
| CantonS | Bloomington Drosophila Stock Center | 9517 | |
| w1118 | Bloomington Drosophila Stock Center | 5905 | |
| yw | Bloomington Drosophila Stock Center | 6599 | |
| Drosophila line used for recombination mapping | Bloomington Drosophila Stock Center | 3227 | Genotype: wg[Sp-1] J[1] L[2] Pin[1]/CyO, P{ry[+t7.2]=ftz/lacB}E3 |
| CyO/sno[Sco] | Bloomington Drosophila Stock Center | 2555 | Drosophila balancer line used for recombination mapping |
| Deficiency Kit for chromosome 2L | Bloomington Drosophila Stock Center | DK2L | Cook et al., 2012 |
| Histology analysis | |||
| Ethanol, (100%) | Thermo Fischer Scientific | A4094 | |
| Chloroform | Thermo Fischer Scientific | C298-500 | |
| Glacial Acetic Acid | Thermo Fischer Scientific | A38-500 | |
| Fisherbrand™ Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL | Thermo Fischer Scientific | 05-408-129 | |
| Histochoice clearing agent 1X | VWR Life Sciences | 97060-934 | |
| Harris Hematoxylin | VWR | 95057-858 | |
| Eosin | VWR | 95057-848 | |
| Thermo Scientific™ Richard-Allan Scientific™ Mounting Medium | Thermo Scientific™ 4112 | 22-110-610 | CyO/sna[Sco] |
| Unifrost Poly-L-Lysine microscope slides, 75x25x1mm, EverMark Select Plus | Azer Scientific | ||
| Fisherbrand™ Cover Glasses: Rectangles | Fisherbrand | 12-545M | Dimensions: 24×60 mm |
| Traceable timer | VWR | ||
| Slide Warmer | Barnstead International | model no. 26025 | |
| Slide tray and racks | DWK Life Sciences | Rack to hold 20 slides | |
| Fisherbrand™ General-Purpose Extra-Long Forceps | Fisherbrand | 10-316A | |
| Kimwipes™ | Kimberly-Clark™ Professional | ||
| 6 inch Puritan applicators | Hardwood Products Company, Guilford, Maine | 807-12 | |
| VWR® Razor Blades | VWR | 55411-050 | |
| Tupperware or glass containers for histology liquids | 16 + 1 for running water | ||
| High Profile Coated Microtome Blades | VWR | 95057-834 | |
| Corning™ Round Ice Bucket with Lid, 4L | Corning™ | ||
| Beaker | Or other container for ice water and cassettes | ||
| Tissue Bath | Precision Scientific Company | 66630 | |
| Microtome | Leica Biosystems | ||
| Molecular analysis | |||
| Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9282 | |
| Ex Taq DNA polymerase | TaKaRa | 5 U/μl | |
| Invitrogen™ SYBR™ Safe™ DNA Gel Stain | Invitrogen™ | ||
| UltraPure™ Agarose | Invitrogen™ | ||
| 1 Kb Plus DNA Ladder | Invitrogen™ | ||
| ApE-A plasmid Editor software | Available for free download | ||
| Statistical analysis | |||
| R software package | |||
| Further analysis | |||
| y[1] w[*]; wg[Sp-1]/CyO; Dr[1]/TM3, Sb[1] | Bloomington Drosophila Stock Center | 59967 | |
References
- Frade, J. M., Ovejero-Benito, M. C. Neuronal cell cycle: the neuron itself and its circumstances. Cell Cycle. 14 (5), 712-720 (2015).
- Aranda-Anzaldo, A. The post-mitotic state in neurons correlates with a stable nuclear higher-order structure. Communicative & Integrative Biology. 5 (2), 134-139 (2012).
- Haelterman, N. A., et al. Large-scale identification of chemically induced mutations in Drosophila melanogaster. Genome Res. 24 (10), 1707-1718 (2014).
- Moresco, E. M., Li, X., Beutler, B. Going forward with genetics: recent technological advances and forward genetics in mice. The American Journal of Pathology. 182 (5), 1462-1473 (2013).
- St Johnston, D. The art and design of genetic screens: Drosophila melanogaster. Nature Reviews Genetics. 3 (3), 176-188 (2002).
- Greenspan, R. J. . Fly pushing: The theory and practice of Drosophila genetics. , (2004).
- Reiter, L. T., Potocki, L., Chien, S., Gribskov, M., Bier, E. A systematic analysis of human disease-associated gene sequences in Drosophila melanogaster. Genome Research. 11 (6), 1114-1125 (2001).
- Rubin, G. M., et al. Comparative genomics of the eukaryotes. Science. 287 (5461), 2204-2215 (2000).
- Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. Journal of Visualized Experiments. (61), (2012).
- Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration. Journal of Visualized Experiments. (49), (2011).
- Karres, J. S., Hilgers, V., Carrera, I., Treisman, J., Cohen, S. M. The conserved microRNA miR-8 tunes atrophin levels to prevent neurodegeneration in Drosophila. Cell. 131 (1), 136-145 (2007).
- Helfrich, C., Engelmann, W. Circadian-Rhythm of the Locomotor-Activity in Drosophila-Melanogaster and Its Mutants Sine Oculis and Small Optic Lobes. Physiological Entomology. 8 (3), 257-272 (1983).
- R Development Core Team. . R: A language and environment for statistical computing. , (2008).
- Bokel, C. EMS screens : from mutagenesis to screening and mapping. Methods in Molecular Bioogyl. 420, 119-138 (2008).
- Lindsley, D. L., Zimm, G. G. . The Genome of Drosophila Melanogaster. , (1992).
- Cook, R. K., et al. The generation of chromosomal deletions to provide extensive coverage and subdivision of the Drosophila melanogaster genome. Genome Biology. 13 (3), R21 (2012).
- Loewen, C., Boekhoff-Falk, G., Ganetzky, B., Chtarbanova, S. A Novel Mutation in Brain Tumor Causes Both Neural Over-Proliferation and Neurodegeneration in Adult Drosophila. Genes Genomes Genetics G3 (Bethesda). 8 (10), 3331-3346 (2018).
- Gloor, G. B., et al. Type I repressors of P element mobility. Génétique. 135 (1), 81-95 (1993).
- Komori, H., Xiao, Q., McCartney, B. M., Lee, C. Y. Brain tumor specifies intermediate progenitor cell identity by attenuating beta-catenin/Armadillo activity. Development. 141 (1), 51-62 (2014).
- Kretzschmar, D., Hasan, G., Sharma, S., Heisenberg, M., Benzer, S. The swiss cheese mutant causes glial hyperwrapping and brain degeneration in Drosophila. The Journal of Neuroscience. 17 (19), 7425-7432 (1997).
- Kang, K. H., Reichert, H. Control of neural stem cell self-renewal and differentiation in Drosophila. Cell and Tissue Research. 359 (1), 33-45 (2015).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted Gene-Expression as a Means of Altering Cell Fates and Generating Dominant Phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Loewen, C. A., Ganetzky, B. Mito-Nuclear Interactions Affecting Lifespan and Neurodegeneration in a Drosophila Model of Leigh Syndrome. Génétique. 208 (4), 1535-1552 (2018).
- Cao, Y., Chtarbanova, S., Petersen, A. J., Ganetzky, B. Dnr1 mutations cause neurodegeneration in Drosophila by activating the innate immune response in the brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (19), E1752-E1760 (2013).
- Lessing, D., Bonini, N. M. Maintaining the brain: insight into human neurodegeneration from Drosophila melanogaster mutants. Nature Reviews Genetics. 10 (6), 359-370 (2009).
- Peng, F., et al. Loss of Polo ameliorates APP-induced Alzheimer’s disease-like symptoms in Drosophila. Scientific Reports. 5, 16816 (2015).
- Venken, K. J., Bellen, H. J. Chemical mutagens, transposons, and transgenes to interrogate gene function in Drosophila melanogaster. Methods. 68 (1), 15-28 (2014).
- Gonzalez, M. A., et al. Whole Genome Sequencing and a New Bioinformatics Platform Allow for Rapid Gene Identification in D. melanogaster EMS Screens. Biology (Basel). 1 (3), 766-777 (2012).
- Palladino, M. J., Hadley, T. J., Ganetzky, B. Temperature-sensitive paralytic mutants are enriched for those causing neurodegeneration in drosophila. Génétique. 161 (3), 1197-1208 (2002).
