In vivo Forward genetisk Screen å identifisere Novel nervecellene gener i Drosophila melanogaster
Summary
Vi presenterer en protokoll ved hjelp av en frem genetisk tilnærming til skjermen for mutanter stiller neurodegeneration i Drosophila melanogaster. Det inkorporerer en klatring analysen, histologi analyse, gen kartlegging og DNA-sekvensering til slutt identifisere romanen gener knyttet til prosessen med neuroprotection.
Abstract
Det er mye å forstå om utbruddet og progresjon av nevrodegenerative sykdommer, inkludert underliggende gener ansvarlig. Forward genetisk screening ved hjelp av kjemiske mutagener er en nyttig strategi for kartlegging mutant fenotyper til gener blant Drosophila og andre modell organismer som deler bevarte cellulære veier med mennesker. Hvis mutert genet av interesse er ikke dødelig i tidlige utviklingsmessige stadier av fluer, en klatring analysen kan gjennomføres på skjermen for fenotypiske indikatorer på redusert hjernefunksjon, for eksempel lav klatring priser. Deretter kan sekundær histologiske analyse av hjernevevet utføres for å verifisere nervecellene funksjon av genet ved scoring neurodegeneration fenotyper. Gene kartlegging strategier inkluderer meiotic og mangel kartlegging som er avhengige av de samme analysene kan etterfølges av DNA-sekvensering for å identifisere mulige nukleotid endringer i genet av interesse.
Introduction
Neurons er for det meste post-mitotisk og ute av stand til å dele1,2. I de fleste dyr, nervecellene mekanismer eksisterer for å opprettholde disse cellene i hele organismen levetid, spesielt i alderdommen når neurons er mest sårbare for skader. Gener underliggende disse mekanismene kan identifiseres i mutanter viser neurodegeneration, en fenotypiske indikator for tap av neuroprotection, ved hjelp av en frem genetisk protokoll. Videresende genetisk skjermene benytter kjemikalie mutagener som etanol methanesulfonate (EMS) eller N-etanol-N-nitrosourea (ENU) er spesielt nyttig på grunn av det tilfeldig punkt mutasjoner de indusere, resulterer inne en iboende upartisk adgang det har kaste lyset opp på tallrike gen funksjoner i eukaryote modell organismer3,4,5 (i kontrast, X-ray mutagenese skaper DNA-pauser og kan resultere i omorganisering snarere enn punkt mutasjoner6).
Den vanlige frukten fly Drosophila melanogaster er et ideelt emne for disse skjermene på grunn av sin høye kvalitet, godt kommentert Genova sekvens, sin lange historie som modell organisme med høyt utviklede genetiske verktøy, og mest betydelig, den delte evolusjonær historie med mennesker7,8. En begrensende faktor i anvendelsen av denne protokollen er tidlig dødelighet forårsaket av muterte gener, som ville hindre testing på gamle9år. Men for ikke-dødelige mutasjoner, en klatring analysen, som utnytter negative geotaxis, er en enkel, men omfattende, metode for kvantifisere nedsatt motorfunksjon10. Å vise tilstrekkelig Locomotor reaktivitet, fluer er avhengig av nevrale funksjoner for å bestemme retning, føle sin posisjon, og koordinere bevegelse. Manglende evne til fluer til tilstrekkelig stigning som følge av stimuli kan derfor indikere nevrologiske defekter11. Når en bestemt defekt klatring fenotype er identifisert, ytterligere testing ved hjelp av en sekundær skjerm som histologiske analyse av hjernevevet, kan brukes til å identifisere neurodegeneration i klatring-defekte fluer. Senere gen kartlegging kan deretter brukes til å avdekke den genomisk regionen på kromosom som bærer det defekte nervecellene genet av interesse. For å innskrenke den kromosom regionen av interesse, meiotic kartlegging ved hjelp av mutant fly linjer bærer dominerende markør gener med kjente steder på kromosom kan utføres. Markør gener fungerer som et referansepunkt for mutasjon som frekvensen av rekombinasjon mellom to Loci gir en målbar avstand som kan brukes til å kartlegge omtrentlig plassering av et gen. Til slutt, krysser de muterte linjene med linjer som frakter balanserte mangler på meiotically kartlagt kromosom regionen av interesse, skaper en komplementering test der genet av interesse kan verifiseres hvis dens kjente fenotype uttrykkes5. Polymorfe nukleotid sekvenser i identifiserte genet, muligens resulterer i en endret aminosyre sekvenser, kan evalueres ved sekvensering genet og sammenligne den med Drosophila Genova sekvensen. Senere karakterisering av genet av interesse kan inkludere testing av ytterligere mutant alleler, mutasjon redning eksperimenter og undersøkelse av ytterligere fenotyper.
Protocol
Representative Results
Discussion
Forward genetiske skjermer i Drosophila har vært en effektiv tilnærming for å identifisere gener involvert i ulike biologiske prosesser, inkludert alder-avhengige neuroprotection5,23,24, 25. ved hjelp av denne strategien, var vi lykkes i å identifisere ungen som en roman nervecellene genet17.
Et kritisk trinn i denne prot…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er spesielt takknemlige for Dr. Barry Ganetzky, i Who ‘ s Lab den genetiske skjermen ble utført, slik at identifisering og karakterisering av ungen som en nervecellene genet. Vi takker Dr. Steven Robinow for vennlig å gi samlingen av ENU-mutagenized fluer brukes i den genetiske skjermen presentert i denne artikkelen. Vi takker medlemmene av Ganetzky Lab, DRS. Grace Boekhoff-Falk og David Wassarman for nyttige diskusjoner gjennom hele prosjektets varighet, Ling Ling Ho og Bob Kreber for teknisk assistanse, Dr. Aki Ikeda for bruk av hans mikrotomen anlegget på University of Wisconsin og Dr. Kim Lackey og den optiske analyse Facility ved University of Alabama.
Materials
| Major equipment | |||
| Fume hood for histology | |||
| Light Microscope | Nikon | Eclipe E100 | Preferred objective for imaging is X20 |
| Imaging software | Nikon | ||
| Microscope Camera | Nikon | ||
| Thermal cycler | Eppendorf | ||
| Fly pushing and climbing assay | |||
| VWR® Drosophila Vial, Narrow | VWR | 75813-160 | |
| VWR® General-Purpose Laboratory Labeling Tape | VWR | 89097-912 | |
| Standard mouse pad | |||
| Stereoscope | Motic | Model SMZ-168 | |
| CO2 anesthesia station (Blowgun, foot valve, Ultimate Flypad) | Genesee Scientific | 54-104, 59-121, 59-172 | Doesn’t iinclude CO2 tank |
| Fine-Tip Brushes | SOLO HORTON BRUSHES, INC. | ||
| Drosophila Incubator | VWR | 89510-750 | |
| Gene mapping | |||
| CantonS | Bloomington Drosophila Stock Center | 9517 | |
| w1118 | Bloomington Drosophila Stock Center | 5905 | |
| yw | Bloomington Drosophila Stock Center | 6599 | |
| Drosophila line used for recombination mapping | Bloomington Drosophila Stock Center | 3227 | Genotype: wg[Sp-1] J[1] L[2] Pin[1]/CyO, P{ry[+t7.2]=ftz/lacB}E3 |
| CyO/sno[Sco] | Bloomington Drosophila Stock Center | 2555 | Drosophila balancer line used for recombination mapping |
| Deficiency Kit for chromosome 2L | Bloomington Drosophila Stock Center | DK2L | Cook et al., 2012 |
| Histology analysis | |||
| Ethanol, (100%) | Thermo Fischer Scientific | A4094 | |
| Chloroform | Thermo Fischer Scientific | C298-500 | |
| Glacial Acetic Acid | Thermo Fischer Scientific | A38-500 | |
| Fisherbrand™ Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL | Thermo Fischer Scientific | 05-408-129 | |
| Histochoice clearing agent 1X | VWR Life Sciences | 97060-934 | |
| Harris Hematoxylin | VWR | 95057-858 | |
| Eosin | VWR | 95057-848 | |
| Thermo Scientific™ Richard-Allan Scientific™ Mounting Medium | Thermo Scientific™ 4112 | 22-110-610 | CyO/sna[Sco] |
| Unifrost Poly-L-Lysine microscope slides, 75x25x1mm, EverMark Select Plus | Azer Scientific | ||
| Fisherbrand™ Cover Glasses: Rectangles | Fisherbrand | 12-545M | Dimensions: 24×60 mm |
| Traceable timer | VWR | ||
| Slide Warmer | Barnstead International | model no. 26025 | |
| Slide tray and racks | DWK Life Sciences | Rack to hold 20 slides | |
| Fisherbrand™ General-Purpose Extra-Long Forceps | Fisherbrand | 10-316A | |
| Kimwipes™ | Kimberly-Clark™ Professional | ||
| 6 inch Puritan applicators | Hardwood Products Company, Guilford, Maine | 807-12 | |
| VWR® Razor Blades | VWR | 55411-050 | |
| Tupperware or glass containers for histology liquids | 16 + 1 for running water | ||
| High Profile Coated Microtome Blades | VWR | 95057-834 | |
| Corning™ Round Ice Bucket with Lid, 4L | Corning™ | ||
| Beaker | Or other container for ice water and cassettes | ||
| Tissue Bath | Precision Scientific Company | 66630 | |
| Microtome | Leica Biosystems | ||
| Molecular analysis | |||
| Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9282 | |
| Ex Taq DNA polymerase | TaKaRa | 5 U/μl | |
| Invitrogen™ SYBR™ Safe™ DNA Gel Stain | Invitrogen™ | ||
| UltraPure™ Agarose | Invitrogen™ | ||
| 1 Kb Plus DNA Ladder | Invitrogen™ | ||
| ApE-A plasmid Editor software | Available for free download | ||
| Statistical analysis | |||
| R software package | |||
| Further analysis | |||
| y[1] w[*]; wg[Sp-1]/CyO; Dr[1]/TM3, Sb[1] | Bloomington Drosophila Stock Center | 59967 | |
References
- Frade, J. M., Ovejero-Benito, M. C. Neuronal cell cycle: the neuron itself and its circumstances. Cell Cycle. 14 (5), 712-720 (2015).
- Aranda-Anzaldo, A. The post-mitotic state in neurons correlates with a stable nuclear higher-order structure. Communicative & Integrative Biology. 5 (2), 134-139 (2012).
- Haelterman, N. A., et al. Large-scale identification of chemically induced mutations in Drosophila melanogaster. Genome Res. 24 (10), 1707-1718 (2014).
- Moresco, E. M., Li, X., Beutler, B. Going forward with genetics: recent technological advances and forward genetics in mice. The American Journal of Pathology. 182 (5), 1462-1473 (2013).
- St Johnston, D. The art and design of genetic screens: Drosophila melanogaster. Nature Reviews Genetics. 3 (3), 176-188 (2002).
- Greenspan, R. J. . Fly pushing: The theory and practice of Drosophila genetics. , (2004).
- Reiter, L. T., Potocki, L., Chien, S., Gribskov, M., Bier, E. A systematic analysis of human disease-associated gene sequences in Drosophila melanogaster. Genome Research. 11 (6), 1114-1125 (2001).
- Rubin, G. M., et al. Comparative genomics of the eukaryotes. Science. 287 (5461), 2204-2215 (2000).
- Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. Journal of Visualized Experiments. (61), (2012).
- Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration. Journal of Visualized Experiments. (49), (2011).
- Karres, J. S., Hilgers, V., Carrera, I., Treisman, J., Cohen, S. M. The conserved microRNA miR-8 tunes atrophin levels to prevent neurodegeneration in Drosophila. Cell. 131 (1), 136-145 (2007).
- Helfrich, C., Engelmann, W. Circadian-Rhythm of the Locomotor-Activity in Drosophila-Melanogaster and Its Mutants Sine Oculis and Small Optic Lobes. Physiological Entomology. 8 (3), 257-272 (1983).
- R Development Core Team. . R: A language and environment for statistical computing. , (2008).
- Bokel, C. EMS screens : from mutagenesis to screening and mapping. Methods in Molecular Bioogyl. 420, 119-138 (2008).
- Lindsley, D. L., Zimm, G. G. . The Genome of Drosophila Melanogaster. , (1992).
- Cook, R. K., et al. The generation of chromosomal deletions to provide extensive coverage and subdivision of the Drosophila melanogaster genome. Genome Biology. 13 (3), R21 (2012).
- Loewen, C., Boekhoff-Falk, G., Ganetzky, B., Chtarbanova, S. A Novel Mutation in Brain Tumor Causes Both Neural Over-Proliferation and Neurodegeneration in Adult Drosophila. Genes Genomes Genetics G3 (Bethesda). 8 (10), 3331-3346 (2018).
- Gloor, G. B., et al. Type I repressors of P element mobility. Génétique. 135 (1), 81-95 (1993).
- Komori, H., Xiao, Q., McCartney, B. M., Lee, C. Y. Brain tumor specifies intermediate progenitor cell identity by attenuating beta-catenin/Armadillo activity. Development. 141 (1), 51-62 (2014).
- Kretzschmar, D., Hasan, G., Sharma, S., Heisenberg, M., Benzer, S. The swiss cheese mutant causes glial hyperwrapping and brain degeneration in Drosophila. The Journal of Neuroscience. 17 (19), 7425-7432 (1997).
- Kang, K. H., Reichert, H. Control of neural stem cell self-renewal and differentiation in Drosophila. Cell and Tissue Research. 359 (1), 33-45 (2015).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted Gene-Expression as a Means of Altering Cell Fates and Generating Dominant Phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Loewen, C. A., Ganetzky, B. Mito-Nuclear Interactions Affecting Lifespan and Neurodegeneration in a Drosophila Model of Leigh Syndrome. Génétique. 208 (4), 1535-1552 (2018).
- Cao, Y., Chtarbanova, S., Petersen, A. J., Ganetzky, B. Dnr1 mutations cause neurodegeneration in Drosophila by activating the innate immune response in the brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (19), E1752-E1760 (2013).
- Lessing, D., Bonini, N. M. Maintaining the brain: insight into human neurodegeneration from Drosophila melanogaster mutants. Nature Reviews Genetics. 10 (6), 359-370 (2009).
- Peng, F., et al. Loss of Polo ameliorates APP-induced Alzheimer’s disease-like symptoms in Drosophila. Scientific Reports. 5, 16816 (2015).
- Venken, K. J., Bellen, H. J. Chemical mutagens, transposons, and transgenes to interrogate gene function in Drosophila melanogaster. Methods. 68 (1), 15-28 (2014).
- Gonzalez, M. A., et al. Whole Genome Sequencing and a New Bioinformatics Platform Allow for Rapid Gene Identification in D. melanogaster EMS Screens. Biology (Basel). 1 (3), 766-777 (2012).
- Palladino, M. J., Hadley, T. J., Ganetzky, B. Temperature-sensitive paralytic mutants are enriched for those causing neurodegeneration in drosophila. Génétique. 161 (3), 1197-1208 (2002).
