In vivo fremad genetisk skærm for at identificere nye neuroprotektive gener i Drosophila melanogaster
Summary
Vi præsenterer en protokol ved hjælp af en fremadrettet genetisk tilgang til skærmen for mutanter udviser neurodegeneration i Drosophila melanogaster. Det indeholder en klatring assay, histologi analyse, genkort lægning og DNA sekventering til sidst identificere nye gener i forbindelse med processen med neuroprotection.
Abstract
Der er meget at forstå om udbrud og progression af neurodegenerative sygdomme, herunder de underliggende gener ansvarlige. Forward genetisk screening ved hjælp af kemiske mutagener er en nyttig strategi for kortlægning af mutant fænotyper til gener blandt Drosophila og andre modelorganismer, der deler bevaret cellulære veje med mennesker. Hvis det muterede gen af interesse ikke er dødelig i tidlige udviklingsmæssige stadier af fluer, kan en klatring analyse udføres til skærmen for fænotypiske indikatorer for nedsat hjernens funktion, såsom lav klatring satser. Efterfølgende kan der udføres sekundær histologisk analyse af hjernevæv for at verificere den neuroprotektive funktion af genet ved at score neurodegeneration fænotyper. Genkortlægnings strategier omfatter meiotisk og mangel kortlægning, der er afhængige af disse samme assays kan efterfølges af DNA sekventering at identificere mulige nukleotid ændringer i genet af interesse.
Introduction
Neuroner er for det meste post-mitotisk og ude af stand til at dividere1,2. I de fleste dyr, neuroprotektive mekanismer eksisterer for at opretholde disse celler i hele organismens levetid, især i alderdommen, når neuroner er mest sårbare over for skader. Gener underliggende disse mekanismer kan identificeres i mutanter udviser neurodegeneration, en fænotypisk indikator for tab af neuroprotection, ved hjælp af en Forward genetiske protokol. Fremad genetiske skærme, der anvender kemiske mutagener såsom ethylmethanesulfonat (EMS) eller N-Ethyl-N-nitrosourea (ENU), er særligt nyttige på grund af de tilfældige punktmutationer, de inducerer, hvilket resulterer i en iboende upartisk tilgang, der har kastet lys over talrige gen funktioner i eukaryote model organismer3,4,5 (i modsætning, X-ray mutagenese skaber DNA-pauser og kan resultere i omorganisering snarere end punktmutationer6).
Den fælles frugtflue Drosophila melanogaster er et ideelt emne for disse skærme på grund af sin høje kvalitet, godt kommenteret genom sekvens, dens lange historie som en model organisme med højt udviklede genetiske værktøjer, og mest væsentligt, dens fælles evolutionær historie med mennesker7,8. En begrænsende faktor i anvendeligheden af denne protokol er tidlig dødelighed forårsaget af de muterede gener, som ville forhindre testning i alderdommen9. Men for ikke-dødelige mutationer, en klatring assay, som udnytter negative geotaxis, er en simpel, men omfattende, metode til kvantificering af nedsat motorisk funktion10. For at udstille tilstrækkelig bevægelses reaktivitet, er fluer afhængige af neurale funktioner for at bestemme retningen, fornemme dens position og koordinere bevægelsen. Fluens manglende evne til at klatre tilstrækkeligt i respons på stimuli kan derfor indikere neurologiske defekter11. Når en bestemt defekt klatring fænotype er identificeret, yderligere testning ved hjælp af en sekundær skærm, såsom histologisk analyse af hjernevæv, kan bruges til at identificere neurodegeneration i klatring-defekte fluer. Efterfølgende genkort lægning kan derefter bruges til at afsløre genomområdet på kromosom, der bærer det defekte neuroprotektive gen af interesse. For at indsnævre det kromosomale område af interesse, kan meiotisk kortlægning ved hjælp af mutant flyve linjer, der transporterer dominerende markørgener med kendte steder på kromosom, udføres. Markør generne tjener som referencepunkt for mutationen, da hyppigheden af rekombination mellem to loci giver en målelig afstand, der kan bruges til at kort sætte den omtrentlige placering af et gen. Endelig skaber passage af de mutante linjer med linjer, der medfører afbalancerede mangler på det meiotisk kortlagte kromosomale område af interesse, en komplementerings test, hvor det genfundne gen kan verificeres, hvis dens kendte fænotype udtrykkes5. Polymorfe nukleotidsekvenser i det identificerede gen, som muligvis resulterer i en ændret aminosyresekvens, kan evalueres ved at sekvente genet og sammenligne det med Drosophila genom-sekvensen. Efterfølgende karakterisering af genet af interesse kan omfatte afprøvning af yderligere mutant alleler, mutation redning eksperimenter og undersøgelse af yderligere fænotyper.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fremad genetiske skærme i Drosophila har været en effektiv metode til at identificere gener, der er involveret i forskellige biologiske processer, herunder aldersbetinget neuroprotection5,23,24, 25. ved hjælp af denne strategi, vi havde succes med at identificere brat som en roman neuroprotektive gen17.
Et kritisk trin i d…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er især taknemmelig for Dr. Barry Ganetzky, i who’s Lab den genetiske skærm blev udført, gør det muligt at identificere og karakterisering af brat som en neuroprotektive gen. Vi takker Dr. Steven Robinow for venligt at give indsamlingen af ENU-mutagenicerede fluer, der anvendes i den genetiske skærm præsenteret i denne artikel. Vi takker medlemmerne af Ganetzky Lab, DRs. Grace Boekhoff-Falk og David Wassarman for nyttige diskussioner under hele projektets varighed, ling ling Ho og Bob Kreber for teknisk assistance, Dr. Aki Ikeda for brug af hans mikrotome facilitet på University of Wisconsin og Dr. Kim Lackey og den optiske analyse facilitet ved University of Alabama.
Materials
| Major equipment | |||
| Fume hood for histology | |||
| Light Microscope | Nikon | Eclipe E100 | Preferred objective for imaging is X20 |
| Imaging software | Nikon | ||
| Microscope Camera | Nikon | ||
| Thermal cycler | Eppendorf | ||
| Fly pushing and climbing assay | |||
| VWR® Drosophila Vial, Narrow | VWR | 75813-160 | |
| VWR® General-Purpose Laboratory Labeling Tape | VWR | 89097-912 | |
| Standard mouse pad | |||
| Stereoscope | Motic | Model SMZ-168 | |
| CO2 anesthesia station (Blowgun, foot valve, Ultimate Flypad) | Genesee Scientific | 54-104, 59-121, 59-172 | Doesn’t iinclude CO2 tank |
| Fine-Tip Brushes | SOLO HORTON BRUSHES, INC. | ||
| Drosophila Incubator | VWR | 89510-750 | |
| Gene mapping | |||
| CantonS | Bloomington Drosophila Stock Center | 9517 | |
| w1118 | Bloomington Drosophila Stock Center | 5905 | |
| yw | Bloomington Drosophila Stock Center | 6599 | |
| Drosophila line used for recombination mapping | Bloomington Drosophila Stock Center | 3227 | Genotype: wg[Sp-1] J[1] L[2] Pin[1]/CyO, P{ry[+t7.2]=ftz/lacB}E3 |
| CyO/sno[Sco] | Bloomington Drosophila Stock Center | 2555 | Drosophila balancer line used for recombination mapping |
| Deficiency Kit for chromosome 2L | Bloomington Drosophila Stock Center | DK2L | Cook et al., 2012 |
| Histology analysis | |||
| Ethanol, (100%) | Thermo Fischer Scientific | A4094 | |
| Chloroform | Thermo Fischer Scientific | C298-500 | |
| Glacial Acetic Acid | Thermo Fischer Scientific | A38-500 | |
| Fisherbrand™ Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL | Thermo Fischer Scientific | 05-408-129 | |
| Histochoice clearing agent 1X | VWR Life Sciences | 97060-934 | |
| Harris Hematoxylin | VWR | 95057-858 | |
| Eosin | VWR | 95057-848 | |
| Thermo Scientific™ Richard-Allan Scientific™ Mounting Medium | Thermo Scientific™ 4112 | 22-110-610 | CyO/sna[Sco] |
| Unifrost Poly-L-Lysine microscope slides, 75x25x1mm, EverMark Select Plus | Azer Scientific | ||
| Fisherbrand™ Cover Glasses: Rectangles | Fisherbrand | 12-545M | Dimensions: 24×60 mm |
| Traceable timer | VWR | ||
| Slide Warmer | Barnstead International | model no. 26025 | |
| Slide tray and racks | DWK Life Sciences | Rack to hold 20 slides | |
| Fisherbrand™ General-Purpose Extra-Long Forceps | Fisherbrand | 10-316A | |
| Kimwipes™ | Kimberly-Clark™ Professional | ||
| 6 inch Puritan applicators | Hardwood Products Company, Guilford, Maine | 807-12 | |
| VWR® Razor Blades | VWR | 55411-050 | |
| Tupperware or glass containers for histology liquids | 16 + 1 for running water | ||
| High Profile Coated Microtome Blades | VWR | 95057-834 | |
| Corning™ Round Ice Bucket with Lid, 4L | Corning™ | ||
| Beaker | Or other container for ice water and cassettes | ||
| Tissue Bath | Precision Scientific Company | 66630 | |
| Microtome | Leica Biosystems | ||
| Molecular analysis | |||
| Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9282 | |
| Ex Taq DNA polymerase | TaKaRa | 5 U/μl | |
| Invitrogen™ SYBR™ Safe™ DNA Gel Stain | Invitrogen™ | ||
| UltraPure™ Agarose | Invitrogen™ | ||
| 1 Kb Plus DNA Ladder | Invitrogen™ | ||
| ApE-A plasmid Editor software | Available for free download | ||
| Statistical analysis | |||
| R software package | |||
| Further analysis | |||
| y[1] w[*]; wg[Sp-1]/CyO; Dr[1]/TM3, Sb[1] | Bloomington Drosophila Stock Center | 59967 | |
References
- Frade, J. M., Ovejero-Benito, M. C. Neuronal cell cycle: the neuron itself and its circumstances. Cell Cycle. 14 (5), 712-720 (2015).
- Aranda-Anzaldo, A. The post-mitotic state in neurons correlates with a stable nuclear higher-order structure. Communicative & Integrative Biology. 5 (2), 134-139 (2012).
- Haelterman, N. A., et al. Large-scale identification of chemically induced mutations in Drosophila melanogaster. Genome Res. 24 (10), 1707-1718 (2014).
- Moresco, E. M., Li, X., Beutler, B. Going forward with genetics: recent technological advances and forward genetics in mice. The American Journal of Pathology. 182 (5), 1462-1473 (2013).
- St Johnston, D. The art and design of genetic screens: Drosophila melanogaster. Nature Reviews Genetics. 3 (3), 176-188 (2002).
- Greenspan, R. J. . Fly pushing: The theory and practice of Drosophila genetics. , (2004).
- Reiter, L. T., Potocki, L., Chien, S., Gribskov, M., Bier, E. A systematic analysis of human disease-associated gene sequences in Drosophila melanogaster. Genome Research. 11 (6), 1114-1125 (2001).
- Rubin, G. M., et al. Comparative genomics of the eukaryotes. Science. 287 (5461), 2204-2215 (2000).
- Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. Journal of Visualized Experiments. (61), (2012).
- Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration. Journal of Visualized Experiments. (49), (2011).
- Karres, J. S., Hilgers, V., Carrera, I., Treisman, J., Cohen, S. M. The conserved microRNA miR-8 tunes atrophin levels to prevent neurodegeneration in Drosophila. Cell. 131 (1), 136-145 (2007).
- Helfrich, C., Engelmann, W. Circadian-Rhythm of the Locomotor-Activity in Drosophila-Melanogaster and Its Mutants Sine Oculis and Small Optic Lobes. Physiological Entomology. 8 (3), 257-272 (1983).
- R Development Core Team. . R: A language and environment for statistical computing. , (2008).
- Bokel, C. EMS screens : from mutagenesis to screening and mapping. Methods in Molecular Bioogyl. 420, 119-138 (2008).
- Lindsley, D. L., Zimm, G. G. . The Genome of Drosophila Melanogaster. , (1992).
- Cook, R. K., et al. The generation of chromosomal deletions to provide extensive coverage and subdivision of the Drosophila melanogaster genome. Genome Biology. 13 (3), R21 (2012).
- Loewen, C., Boekhoff-Falk, G., Ganetzky, B., Chtarbanova, S. A Novel Mutation in Brain Tumor Causes Both Neural Over-Proliferation and Neurodegeneration in Adult Drosophila. Genes Genomes Genetics G3 (Bethesda). 8 (10), 3331-3346 (2018).
- Gloor, G. B., et al. Type I repressors of P element mobility. Génétique. 135 (1), 81-95 (1993).
- Komori, H., Xiao, Q., McCartney, B. M., Lee, C. Y. Brain tumor specifies intermediate progenitor cell identity by attenuating beta-catenin/Armadillo activity. Development. 141 (1), 51-62 (2014).
- Kretzschmar, D., Hasan, G., Sharma, S., Heisenberg, M., Benzer, S. The swiss cheese mutant causes glial hyperwrapping and brain degeneration in Drosophila. The Journal of Neuroscience. 17 (19), 7425-7432 (1997).
- Kang, K. H., Reichert, H. Control of neural stem cell self-renewal and differentiation in Drosophila. Cell and Tissue Research. 359 (1), 33-45 (2015).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted Gene-Expression as a Means of Altering Cell Fates and Generating Dominant Phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Loewen, C. A., Ganetzky, B. Mito-Nuclear Interactions Affecting Lifespan and Neurodegeneration in a Drosophila Model of Leigh Syndrome. Génétique. 208 (4), 1535-1552 (2018).
- Cao, Y., Chtarbanova, S., Petersen, A. J., Ganetzky, B. Dnr1 mutations cause neurodegeneration in Drosophila by activating the innate immune response in the brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (19), E1752-E1760 (2013).
- Lessing, D., Bonini, N. M. Maintaining the brain: insight into human neurodegeneration from Drosophila melanogaster mutants. Nature Reviews Genetics. 10 (6), 359-370 (2009).
- Peng, F., et al. Loss of Polo ameliorates APP-induced Alzheimer’s disease-like symptoms in Drosophila. Scientific Reports. 5, 16816 (2015).
- Venken, K. J., Bellen, H. J. Chemical mutagens, transposons, and transgenes to interrogate gene function in Drosophila melanogaster. Methods. 68 (1), 15-28 (2014).
- Gonzalez, M. A., et al. Whole Genome Sequencing and a New Bioinformatics Platform Allow for Rapid Gene Identification in D. melanogaster EMS Screens. Biology (Basel). 1 (3), 766-777 (2012).
- Palladino, M. J., Hadley, T. J., Ganetzky, B. Temperature-sensitive paralytic mutants are enriched for those causing neurodegeneration in drosophila. Génétique. 161 (3), 1197-1208 (2002).
