Här presenterar vi ett protokoll för att detektera tumör somatiska mutationer i cirkulerande DNA som finns i patientens biologiska vätskor (biofluider). Vår dropp Digital polymeras kedjereaktion (dpcr)-baserad metod möjliggör kvantifiering av tumör mutation alleliska frekvens (MAF), underlätta ett minimalt invasiva komplement till diagnos och tidsmässig övervakning av tumörrespons.
Komplikationer i samband med upfront och upprepa kirurgisk vävnad provtagning presentera behovet av minimalt invasiva plattformar som kan molekylär sub-klassificering och tidsmässig övervakning av tumörsvar på behandling. Här beskriver vi vår dPCR-baserade metod för detektion av tumör somatiska mutationer i cellfritt DNA (cfDNA), lätt tillgängligt i patientens biofluider. Även begränsad i antalet mutationer som kan testas för i varje analys, denna metod ger en hög grad av känslighet och specificitet. Övervakning av Mutations överflöd, som beräknas av MAF, möjliggör utvärdering av tumörsvar på behandling, vilket ger en välbehövlig komplement till radiografisk avbildning.
På grund av begränsningar i tillgången på tumör vävnad för molekylära analyser, det finns ett behov av att utveckla mycket känsliga metoder som kan upptäcka tumör somatiska mutationer i patientens biofluider, inklusive plasma, serum och cerebrospinalvätska (CSF) . Till exempel, barn diffus mittlinjen gliom (dmgs) presentera en utmaning på grund av deras neuroanatomiska läge. Under det senaste decenniet, molekylär profilering av DMG vävnadsprov har avslöjat driver mutationer i denna tumörtyp1 och har avslöjat rumsliga och temporala heterogenitet av mutationer, vilket gör biopsi som krävs för att karakterisera en patient inom en sjukdom undergruppen och främja molecularly-riktade terapier2. Som sådan, kliniska prövningar förespråkar för att integrera kirurgiska biopsier för tumör molekylär profilering vid initial diagnos3,4,5,6. Under behandlingen, övervakning av terapeutiska svar i DMGs är begränsad till MRI, som saknar känslighet för att upptäcka små förändringar eller tumör genomisk evolution. MRI är också benägna att upptäcka pseudoprogression, övergående inflammation på platsen för tumören som härmar sann progression på avbildning och kan vilseleda tolkning av tumörsvar7. Sålunda, DMGs representera en tumörtyp med ett stort behov av ett alternativ, minimalt invasiva sätt att upptäcka tumör mutationer och övervakning kliniskt svar. För att tillgodose dessa behov utvecklade och optimerade vi ett protokoll för att upptäcka, och kvantifiera den alleliska frekvensen av, tumör mutationer i cfdna från plasma, serum och CSF av barn med mittlinjen gliom8. Med tanke på att barndomen DMGs ofta (> 80%) Harbor en somatisk lysin till metionin mutation vid position 27 i Histon variant h 3.1 (h 3.1 k27m, 20% av fallen) eller h 3.3 (h 3.3 k27m, 60% av fallen)1, dessa och andra mutationer karakteristiska för dmgs (dvs ACVR1, PIK3R1) var riktade till den muterade allelekvantifieringen med cfDNA8. Denna analys kan skräddarsys för att upptäcka hotspot mutationer i andra tumörtyper med sekvens-specifika primers och sonder. Mångsidigheten hos denna metod gör den tillämplig på en mängd olika cancerformer som skulle gynnas av integrationen av cfDNA-baserade diagnostiska verktyg och terapeutisk övervakning.
För att på ett känsligt sätt upptäcka låga alleliska frekvens mutationer i cfdna använder vi en dropp Digital PCR (dpcr)-baserad metod. I denna metod är PCR-reaktionen blandningen uppdelad i ett teoretiskt maximum av 10 000 000 droppar med hjälp av dPCR-plattformen (t. ex. RainDance), med 7-9 miljoner droppar per PCR väl typiskt sett experimentellt. På grund av den höga graden av prov partitionering, högst en till två DNA-molekyler kan förekomma i varje droppe. PCR amplifiering och sekvens-specifik fluorescerande sond hybridisering kan förekomma i varje droppe, så att miljontals reaktioner äger rum. Detta maximerar känsligheten och möjliggör detektering av sällsynta Mutant alleler, som annars kan gå oupptäckt mot en bakgrund av vildtyp DNA. Utnyttjandet av låsta nukleinsyra (lna) sonder förstärker specificiteten av analysen genom att begränsa obalans hybridisering och stödja korrekt mutation upptäckt9,10,11. Här beskriver vi våra metoder för provbearbetning, cfDNA-extraktion, preamplifiering av mål-alleler, dPCR och dataanalys.
Här har vi presenterat vår metod för att detektera och kvantifiera den alleliska frekvensen av tumör mutationer i cfDNA från patientens vätskebiopsi. Vi betonar kritiska steg för framgången för denna metod, inklusive pre-analytisk provbearbetning, cfDNA utvinning, PCR-analys design och dataanalys. För att begränsa provvolymen som används extraheras cfDNA från 1 mL plasma, men endast 500 μL CSF. Vid extraktion från CSF används protokollet för extraktion från 1 mL urin (enligt handboken för cfDNA Extraction Kit12), enligt tillverkarens rekommendation. Skillnaden i provvolym som krävs mellan plasma och CSF beror på lägre nivåer av tumörspecifika cfDNA i plasma jämfört med CSF av patienter med hjärntumörer, kräver större provvolymer för mutation Detection8. Om provet finns tillgängligt kan mer än 1 mL plasma extraheras från för att ge högre DNA-avkastning. Men, när det gäller pediatriska patienter, det är viktigt att minimera mängden blod som används när det är möjligt, som även ett enkelt förfarande såsom blod dragning är trött på pediatriska patienter med cancer som genomgår strålbehandling. Extraktion från 1 mL-alikvoter av plasma möjliggör även replikeringar, så att analysen kan upprepas (t. ex. vid fel i DNA-extraktion eller prov förorening).
I ett försök att minska alla provanvändning som inte är strikt nödvändigt, är cfDNA vanligtvis inte kvantifieras. Emellertid, vi har funnit en rad cfDNA koncentrationer mellan 0,2-2 ng/μL och 0,6-13 ng/μL i plasma och CSF, respektive. Med tanke på den låga mängden cfDNA, och det faktum att tumörspecifika muterade alleler är närvarande vid en låg frekvens, är ett för förstärknings steg med samma uppsättning primrar som används för dPCR nödvändigt för att avsevärt öka mängden måldna i provet, medhjälp i mutation detektion8. Spädning av pre-Amplified produkten i DNA suspension buffert ger tillräcklig volym för tekniska replikat, som hjälper till att skilja sanna positiva. Eftersom antalet muterade droppar kan vara lågt (till exempel mellan 0-2 Mutant droppar i ett plasmaprov), är införandet av tekniska replikat nyckeln för att lösa mutationsstatus. Medan en PCR-brunn kan ge 0 muterade droppar, kan de andra två ge 1-2 för ett enda plasmaprov som analyseras i tre exemplar; Sålunda, införandet av replikat möjliggör större noggrannhet vid bestämning av mutationsstatus. MAF beräknas sedan som medelvärdet av de replikerade värdena.
Multiplexed pre-amplifiering (preamplifying vildtyp och Mutant alleler av två mutationer av intresse) ökar nyttan av ett enda prov, som samma utgångsmaterial kan användas för att testa för två mutationer. Viktigt, en multiplex ger produkt kan analyseras i singleplex under dpcr för större enkelhet, som beskrivs här. Både ger PCR och dpcr kan dock multiplexeras. Vid multiplexering måste villkoren optimeras för båda uppsättningarna primrar och sonder: primerglödgningstemperatur måste likna vid att köras tillsammans i PCR-amplifiering, och sonderna bör utformas för att generera distinkta kluster (baserat på fluorescerande signaler och intensitet). Vid validering av en ny uppsättning primers och sonder, kör en glödgning temperaturgradient för att bestämma optimal glödgning temperatur baserat på det intervall som föreslagits av tillverkaren. Innan tester sonder på patienten cfDNA prover, validera dem med hjälp av syntetiska DNA-konstruktioner och/eller tumör vävnad gDNA av olika ingångar (dvs., upp till 10 ng).
För detektion av muterade alleler med större specificitet och minskad missmatchningar i hybridisering av sonden till mål-DNA, låst nukleinsyra (LNA) sonder används. Lna är en nukleinsyra analog med en metylenblått bro som förbinder 2 ‘-syre och 4 ‘-Carbon av ribose ring9. Den metylenblått Bridge låser nukleinsyran i en styv bicykliska konformation som begränsar flexibiliteten, ökar termisk duplex stabilitet, och förbättrar specificiteten hos sond hybridisering till mål-DNA10,18, 19. om en enda bas obalans finns mellan lna sond och mall DNA, duplex formation mellan sond och Target kommer att destabilisera. Som sådan, LNA sonder förbättra specificiteten av sond bindning och resultera i en högre signal-till-brus-förhållande11. Analys av plasma och CSF från icke-CNS-diseased pediatriska patienter har etablerat specificiteten av vår analys med lna sonder inriktning H3F3A p. K27M, att fastställa att en alleliska frekvens av lika med eller mindre än 0,001% anses vara en falsk positiv 8. för ytterligare överväganden för att optimera utformningen av sonder och primers, inklusive GC innehåll, amplikon storlek, PROBE reporter färgämnen, och quenchers, hänvisa till dpcr tillverkarens riktlinjer14,17. Även om vår metod är optimerad för användning med RainDance-systemet, kan protokollet anpassas för användning med andra dPCR-plattformar.
Den metod som presenteras här drar styrka från hög känslighet och mål berikning uppnås genom dPCR, som förblir den plattform för val för att upptäcka sällsynta tumör mutationer i cfDNA. Även kraftfull, dPCR är begränsad i antalet mutationer som kan testas för i en enda analys. Ett alternativ till dPCR är nästa generations sekvensering (NGS), som kan detektera flera mutationer över många gener, vilket ökar nyttan av ett enda prov. NGS kan detektera mutationer i CSF och plasma hos patienter med hjärnstammen gliom20är dock för närvarande mindre känslig än dpcr vid detektering av tumör mutationer i cfdna, med detektionsgränser på 0,1-10% MAF jämfört med 0,001% i PCR-baserade metoder21 . dPCR uppnår också snabbare handläggningstid än NGS, vilket möjliggör snabb detektering av mutationer av intresse. PCR-metoden gäller för olika cancertyper och kan utökas för att detektera hotspot-mutationer och metylerat cfDNA22.
Den flytande biopsi är verkligen i sin linda och kommer att kräva ytterligare utveckling för att skräddarsy till specifika sjukdomar. Tumör övervakning i samband med tumörutveckling kommer att bli nästa utmaning, där en plattform som kan upptäcka nya mutationer med hög känslighet skulle krävas. Dessutom, plattformar som kan upptäcka en mängd olika biomolekyler (peptider, cytokiner, RNA) kommer att vara mycket fördelaktigt att bedöma tumörsvar på behandling, samt avancera personliga kliniska interventioner.
The authors have nothing to disclose.
Författarna skulle vilja erkänna generositeten hos alla patienter och deras familjer. Detta arbete stöddes av finansiering från Smashing Walnuts Foundation (Middleburg, VA), V Foundation (Atlanta, GA), den Gabriella Miller Kids första data Resource Center, kliniska och translationella Science Institute på Children ‘ s National ( 5UL1TR001876-03), Musella Foundation (Hewlett, NY), Matthew Larson Foundation (Franklin Lake, NJ), den Lilabean Stiftelsen för pediatrisk hjärn cancer forskning (Silver Spring, MD), barndoms hjärntumör stiftelse (Germantown, MD), barnens hjärna Tumör vävnad konsortium (Philadelphia, PA), och Rally Foundation för barn cancer forskning (Atlanta, GA).
10mM Tris-HCl, 0.1mM EDTA DNA Suspension Buffer (pH 8.0) | Teknova | T0227 | |
BD Vacutainer K2-EDTA 7.2mg Blood Collection Tubes (10mL) | Becton Dickinson Diagnostics | 367525 | For plasma collection |
BD Vacutainer Plastic Serum tube with Red BD Hemogard Closure (10mL) | Becton Dickinson Diagnostics | 367895 | For serum collection |
Bleach | General Lab Supplier | ||
Buffer ATL | Qiagen | 19076 | |
Cell-Free DNA Blood Collection Tubes | Streck | 218961 | cfDNA blood collection tubes (optional) |
CentriVap Concentrator | Labconco | 7810010 | |
Forward Primer | Integrated DNA Technologies, Inc. | Custom design | |
MiniAmp Thermal Cycler | Thermofisher Scientific | A37834 | |
Molecular Biology Grade Absolute Ethanol (200 proof) | General Lab Supplier | ||
Mutant Probe | Integrated DNA Technologies, Inc. | Custom design | |
PAXgene Blood ccfDNA tubes | PreAnalytiX | 768115 | cfDNA blood collection tubes (optional) |
PCR 8 well strip tube caps | VWR | 10011-786 | |
PCR 8 well strip tubes | Axygen | PCR-0208-C | |
Pipette (p20, p200, p1000) | General Lab Supplier | ||
Pipette filter tips (p20, p200, p1000) | General Lab Supplier | ||
Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix | New England Biolabs Inc | M0494S | |
QIAamp Circulating Nucleic Acid HandBook | Qiagen | cfDNA extraction kit handbook (2013 edition) | |
QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit | Qiagen | 55114 | cfDNA extraction kit (Protocol Step 4) |
QIAamp MinElute Virus Spin Kit | Qiagen | 57704 | Optional kit for DNA extraction from small (< or =200µL) sample volumes |
Qiavac 24 Plus | Qiagen | 19413 | For use with QIAamp Circulating Nucleic Acids kit |
Raindance Consumable Kit | Bio-Rad | 20-04411 | Contains droplet-generating instrument chips, quantification instrument chips, PCR strip caps including high-speed caps, and droplet stabilizing oil |
Raindance Sense Instrument | Bio-Rad | Quantification instrument (used in Protocol Step 9) | |
Raindance Source Instrument | Bio-Rad | Droplet-generating instrument (used in Protocol Step 9) | |
RainDrop Analyst II Software | RainDance Technologies | Analyst software used for Data Analysis (Protocol Step 10) | |
Refrigerated Vapor Trap | Savant | RVT5105-115 | |
Reverse Primer | Integrated DNA Technologies, Inc. | Custom design | |
Smartblock 2mL | Eppendorf | 05 412 506 | |
TaqMan Genotyping Master Mix | Thermofisher Scientific | 4371353 | |
Thermomixer C | Eppendorf | 14 285 562PM | |
WT Probe | Integrated DNA Technologies, Inc. | Custom design |