यह विधि वयस्क zebrafish के वक्ष में समाधान के 0.5 − 3 μL के इंजेक्शन पर निर्भर करती है । प्रक्रिया कुशलता से शरीर को नुकसान पहुंचाए बिना zebrafish दिल की निकटता में प्रोटीन और रासायनिक यौगिकों उद्धार । यह उपागम हृदय के विभिन्न ऊतकों पर बहिर्जात कारकों के प्रभावों के परीक्षण के लिए उपयुक्त है ।
वयस्क zebrafish दिल हृदय उत्थान अनुसंधान में एक शक्तिशाली मॉडल प्रदान करता है । हालांकि इस प्रणाली की शक्ति ट्रांसजेनिक दृष्टिकोण पर आधारित है, बहिर्जात कारकों की एक तेजी से वितरण कार्यात्मक अध्ययन में एक पूरक तकनीक प्रदान करता है । यहाँ, हम मायोकार्डियल क्षति के कारण के बिना हृदयावरणी गुहा में समाधान के कुछ microliters के प्रशासन पर निर्भर करता है कि एक विधि प्रस्तुत करते हैं । अन्तर्वक्षीय (IT) इंजेक्शन कुशलतापूर्वक प्रोटीन और रासायनिक यौगिकों सीधे दिल की सतह पर वितरित कर सकते हैं । यह अंतःक्षिप्त पदार्थ एपिकार्डियम के माध्यम से हृदय के ऊतकों में विसरित होते हैं । Intraperitoneal (आईपी) इंजेक्शन की तुलना में, intraवक्ष इंजेक्शन का मुख्य लाभ लक्ष्य अंग पर परीक्षण किया कारकों का फोकल प्रशासन है. सीधे हृदयावरण में अणुओं की डिलीवरी वयस्क zebrafish में कार्डिएक प्रीकंडीशनिंग और उत्थान के अध्ययन के लिए एक उपयुक्त रणनीति है ।
रीढ़ की हड्डीयों में, zebrafish के पास अपने दिलों को पुनर्जीवित करने के लिए एक उल्लेखनीय क्षमता है1,2। यह क्षमता कई चोट मॉडलों में सूचित किया गया है, अर्थात् वेंट्रिकुलर एपेक्स लकीर, cryoinjury (सीआई) और आनुवंशिक कार्डिओसाइटोसाइट अपक्षरण3,4,5,6,7. आक्रामक चोटों के बाद, वेंट्रिकल की क्षतिग्रस्त दीवार transiently ऊतक, जो उत्तरोत्तर एक नए मायोकार्डियम8,9,10,11द्वारा प्रतिस्थापित किया जाता है द्वारा चंगा हो जाता है । जल्दी घाव भरने की प्रतिक्रिया एपिकरडियम सक्रियण और प्रतिरक्षा कोशिकाओं की भर्ती शामिल12,13,14,15। सहवर्ती, घायल मायोकार्डियम के पास cardiomyocytes सक्रिय हो जाते हैं, dedifferentiate, पैदा करना और उत्तरोत्तर 30 के भीतर घायल क्षेत्र की जगह − 90 दिन16,17,18, 19. हृदय उत्थान के आणविक और सेलुलर तंत्र के गूढ़ रहस्य को हासिल किया गया है, जो आनुवंशिक साधनों की उपलब्धता की बदौलत प्राप्त हुआ है, जैसे कोशिका-वंशावली अनुरेखण विश्लेषण, इंदुच्य जीन अधिव्यंजक, फ्लोरोसेंट ऊतक रिपोर्टर लाइनों, और crispr/Cas9 जीन mutagenesis20,21।
हम हाल ही में thoracotomy22,23द्वारा वयस्क zebrafish में कार्डियक प्रीकंडीशनिंग के एक मॉडल की स्थापना की है । Preconditioning हृदय सुरक्षात्मक जीन की अभिव्यक्ति बढ़ जाती है और बरकरार है और regenerating दिल में कोशिका चक्र में फिर से प्रवेश उठ । इन प्रक्रियाओं प्रतिरक्षा कोशिकाओं और मैट्रिक्स remodeling22,24की भर्ती के साथ जुड़े रहे हैं । प्रीकंडीशनिंग के तंत्र खराब समझ रहे हैं, और नई तकनीकों की स्थापना के लिए अनुसंधान के इस क्षेत्र को बढ़ावा देने की आवश्यकता है । विशेष रूप से, स्रावित संकेतन प्रोटीन या अन्य रासायनिक यौगिकों के अनुकूलित प्रशासन आगे इस विषय की जांच करने के लिए आवश्यक है.
जलीय पशु होने के नाते, zebrafish स्वाभाविक रूप से उनके गहरे नाले और त्वचा के माध्यम से पानी में घुले हुए विभिन्न पदार्थों को अवशोषित कर सकता है । यह विविध रसायनों के साथ समाधान में मछली के विसर्जन के माध्यम से गैर इनवेसिव दवा वितरण के लिए एक संभावना प्रदान करता है, ऐसे औषधीय inhibitors, स्टेरॉयड हार्मोन, tamoxifen, BrdU और एंटीबायोटिक दवाओं के रूप में. वास्तव में, हमारे25,26,27सहित विभिन्न प्रयोगशालाओं से कई अध्ययनों ने इस पद्धति का लाभ उठाया है, जो कि पुनर्योजी जीव विज्ञान के क्षेत्र में विशेष रूप से मूल्यवान है । 28. तथापि, यह तरीका है, पेप्टाइड, डीएनए, आरएनए, morpholinos या एक सीमित ऊतक पारगम्यता के साथ अणुओं की डिलीवरी के लिए उपयुक्त नहीं है । इन मामलों में, एक और अधिक कुशल प्रसव के शरीर में microinjection द्वारा हासिल की है, उदाहरण के लिए, रेट्रो नेत्रगुहा शिरापरक साइनस में केशिका डालने के द्वारा, intraperitoneal या intrapericardial गुहिका में29,30, ३१। यहाँ हम वयस्क zebrafish में दिल पुनर्जनन और प्रीकंडीशनिंग का अध्ययन करने के लिए एक उपयुक्त विधि के रूप में, समाधान की एक छोटी राशि के अंतर्वक्षीय इंजेक्शन की एक प्रक्रिया का वर्णन ।
यहाँ, हम हृदयावरणी गुहा में बहिर्जात यौगिकों और प्रोटीन देने के लिए एक विधि का वर्णन करने के लिए वयस्क zebrafish में दिल पर उनके प्रभाव का अध्ययन करने के लिए । प्रक्रिया अंतर्वक्षीय इंजेक्शन, जो अंग के आसपास के क्षेत्र में समाधान की एक छोटी सी मात्रा की डिलीवरी में परिणाम पर आधारित है । इस तकनीक को विकसित किया गया था और कार्डिएक प्रीकंडीशनिंग और उत्थान का अध्ययन करने के लिए वर्णित है ।
इस प्रक्रिया में महत्वपूर्ण कदम वक्ष गुहा में कांच केशिका के प्रवेश है । इस कदम तीन मापदंडों पर निर्भर करता है: कठोरता और केशिका टिप के sharpness, प्रवेश के कोण, और पंचर साइट । त्वचा के माध्यम से प्रवेश का अनुकूलन करने के लिए, केशिका का खींचा हिस्सा बहुत लंबा नहीं होना चाहिए, के रूप में इस तरह की सुई भी लचीला कर रहे हैं और त्वचा के साथ संपर्क में झुकना. इस से बचने के लिए, कठोरता iridectomy कैंची के साथ टिप आकार को कम करने के द्वारा अनुकूलित किया जा सकता है । हालांकि प्रवेश के कोण 30 डिग्री और ४५ ° के बीच भिंन हो सकते हैं, यह टिप की कठोरता के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । वास्तव में, एक पतली टिप एक संकरा कोण के साथ बेहतर त्वचा घुसना होगा ।
आदेश में सुई प्रवेश का अनुकूलन करने के लिए, प्रविष्टि साइट तुरंत धड़कन दिल से ऊपर होना चाहिए । दिल पंचर होने का खतरा आमतौर पर 5% और 8% के बीच लेकर कम है । दिल के पीछे सुई की प्रविष्टि दिल पंचर का खतरा बढ़ जाता है, के रूप में बढ़ाया रक्तस्राव से देखा । ऐसे मामलों में पशुओं को प्रयोग से दूर करना चाहिए ।
आईटी इंजेक्शन के दौरान परेशानी का एक अंय स्रोत केशिका स्तर पर होता है । वास्तव में केशिका टूट सकता है जब पार्श्व बलों पर exerted हैं । इससे बचने के लिए सुई को सीधे रास्ते में इंजेक्शन की धुरी के साथ-साथ चलना चाहिए । कभी-कभार, केशिका को ऊतक के अवशेषों द्वारा अवरुद्ध किया जा सकता है जो तरल को बहने से रोकते हैं । सुई धीरे से टिप whilst इंजेक्शन को वापस लेने के अनब्लॉक किया जा सकता है । इस प्रवाह में सुधार नहीं करता है, तो हम पूरी तरह से छाती से सुई वापस लेने और सुई की जगह की सलाह देते हैं ।
पेरिकरडियम में बहुत गहराई से डाली गई सुई के कारण घाव हो सकते हैं । हृदयावरण कोश में घावों से बचने के लिए सुई को वक्ष में बहुत अधिक (1 − 2 मिमी) नहीं डाला जाना चाहिए । इंजेक्शन की मात्रा 8 μL से बड़ी थी, जब कुछ लीक देखा गया ।
Zebrafish में, हृदयावरणी द्रव की सटीक संरचना अज्ञात है । हालांकि, हृदयावरणी गुहा की मात्रा ~ 10 μl31का अनुमान है । यह देखते हुए कि वयस्क zebrafish वेंट्रिकल की मात्रा लगभग है 1 − 2 मिमी3, हम मानते है कि हृदयावरणी गुहा तदनुसार एक छोटे मात्रा है, जो इंजेक्शन से पहले विचार किया जाना है । हमारे प्रारंभिक अध्ययनों से, हमने निर्धारित किया है कि इंजेक्शन की मात्रा की इष्टतम रेंज के बीच है ०.५ और मछली के लिए 3 μL मापने के लिए 2.5 − 2.8 सेमी (थून से पुच्छल peduncle की दूरी) । इस मात्रा मछली के आकार के आधार पर अनुकूलित किया जा सकता है । 5 μL तक के इंजेक्शन इस आकार की मछली में किसी भी घाव पैदा नहीं किया । हालांकि, 8 μL से मात्रा उभड़ा हुआ और आंतरिक रक्तस्राव के रूप में चित्र 1Fमें दिखाया गया करने के लिए पर्याप्त थे । इस डेटा के आधार पर, हम अनुमान लगाते है कि 3 μL से बड़ा समाधान की मात्रा अंग पर शारीरिक और शरीरक्रियात्मक तनाव पैदा कर सकती है । इस सीमा के बजाय इंजेक्शन समाधान की मात्रा में वृद्धि के अणुओं की एक उच्च एकाग्रता का चयन करने की जरूरत है infers ।
एक अंय महत्वपूर्ण कारक इंजेक्शन समाधान के परासरणी गुण है, जो शारीरिक सीमा में होना चाहिए । दरअसल, परासरणी तनाव के जोखिम से बचने के लिए, हम इंजेक्शन माध्यम के रूप में HBSS सलाह देते हैं ।
Zebrafish में, आम तरीकों दवाओं देने के लिए इस्तेमाल किया जल उपचार और intraperitoneal इंजेक्शन के माध्यम से कर रहे हैं30,३५. हालांकि इन तकनीकों के दोनों कई अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त हैं, यह इंजेक्शन प्रयोगात्मक और आर्थिक लाभ प्रदान करते हैं, अवांछित प्रणालीगत दुष्प्रभाव के जोखिम को कम करने और महंगा अणुओं के उपयोग को कम करने, क्रमशः । इस विधि tamoxifen की डिलीवरी के लिए उपयुक्त हो सकता है कोशिका वंश विश्लेषण अनुरेखण के लिए इस्तेमाल किया Cre-ERT2 ट्रांसजेनिक प्रणाली को सक्रिय करने के लिए, और गाइड पुनर्जनन अनुसंधान में कार्यात्मक अध्ययन के लिए RNAs संशोधित.
Zebrafish में आईटी-इंजेक्शन विधि पहले31,३६वर्णित किया गया है । उन रिपोर्टों में, अंतर्वक्षीय इंजेक्शन इंसुलिन सुई के साथ प्रदर्शन किया गया, पूर्वकाल पक्ष से पंचर. इसके विपरीत, हमारे प्रोटोकॉल खींचा ग्लास केशिका पीछे की दिशा से डाला के साथ एक वैकल्पिक रणनीति प्रस्तुत करता है । विशेष रूप से, हमारे दृष्टिकोण खाते में मछली हृदयावरण के एनाटॉमी दिल पंचर के एक कम जोखिम के साथ इंजेक्शन का अनुकूलन लेता है । इसके अलावा, प्रक्रिया के दौरान, मछली धातु forceps द्वारा आयोजित नहीं है, लेकिन एक नम और नरम स्पंज, जो एक अधिक उपयुक्त तरीका है मछली के किसी भी बाहरी चोट से बचने के द्वारा । इस प्रकार, प्रस्तुत की विधि बेहतर कार्डिएक homeostasis के अध्ययन के लिए अनुकूल हो सकता है, वयस्क zebrafish में प्रीकंडीशनिंग और उत्थान ।
स्तनधारी मॉडल जीवों में आईटी इंजेक्शन पहले ही स्थापित हो चुके हैं । दरअसल, इस विधि भी सूअरों और मनुष्यों में नैदानिक अध्ययन के साथ प्रयोगों में लागू किया गया है३७,३८. चूहों में, transthoracic intramyocardial इंजेक्शन ultrasounds द्वारा निर्देशित उनके दिल३९को चुनौती देने के लिए इस्तेमाल किया गया है । इस लेख के भीतर हम zebrafish के लिए IT इंजेक्शन के उपयोग को कम करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का प्रस्ताव । यह विशेष रूप से क्षेत्र के लिए मूल्यवान होगा, क्रम में हृदय homeostasis में आनुवंशिक दृष्टिकोण पूरक, प्रीकंडीशनिंग और पुनर्जनन अनुसंधान ।
The authors have nothing to disclose.
हम उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए और मछली की देखभाल के लिए V. Zimmermann धंयवाद, डी König (फ्रीबोर्ग विश्वविद्यालय) पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए, डी Kressler (फ्रीबोर्ग के विश्वविद्यालय) zCNTF प्रोटीन संश्लेषण, एफ Ruggiero (Institut de Génomique के साथ मदद के लिए) Fonctionnelle डी ल्यों) ColXII एंटीबॉडी प्रदान करने के लिए, और पी मार्टिन (ब्रिस्टल विश्वविद्यालय) एल के लिए-प्लास्टर एंटीबॉडी. हम इमेजिंग कोर सुविधा और fribourg विश्वविद्यालय में प्रोटियोमिक् मंच धंयवाद । इस काम के स्विस राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन, अनुदान संख्या 310030_179213, और Schweizerische Herzstiftung (स्विस हार्ट फाउंडेशन) द्वारा समर्थित था ।
Hanks Balanced Salt Solution | Gibco by Life technology | 14065-056 | |
Iridectomy scissor | Roboz Surgical Instruments Co | RS-5602 | |
Macroscope (binocular) | M400 | with Apozoom | |
Micro-injector femtojet | Eppendorf | 5247 0034 77 | |
Microloaders femtotips | Eppendorf | 5242 956.003 | |
Micropipette glass needles type C | WPI | TW100F-6 | thin-wall capillary |
Micropipette puller model P-87 | Flaming/Brown | 20081016 | filament box 2.5 x 4.5 mm |
Sponge | any | any | dim. carved sponge 7cm x 3 cm x 1 cm |
Tricaine (Anestethic) | Sigma | E10521 | |
Dyes and Antibodies | Company | Catalog number | Comments |
anti-Chicken Cy5 | Jackson ImmunoResearch Laboratories | Concentration: 1 / 500 | |
anti-Guinea pig Cy5 | Jackson ImmunoResearch Laboratories | Concentration: 1 / 500 | |
anti-Rabbit Cy5 | Jackson ImmunoResearch Laboratories | Concentration: 1 / 500 | |
Chicken l-plastin | gift from P. Martin, Bristol | Concentration: 1 / 1000 | |
DAPI | Sigma | 10236276001 | Concentration: 1 / 2000 (1µg/ml); 1/100 IT injected |
Guinea pig anti-ColXII | gift from Florence Ruggerio, Lyon | Concentration: 1 / 500 | |
Phalloidin-Atto-565 (F-actin) | Sigma | 94072 | Concentration: 1 / 500 |
Phalloidin-Atto-647 (F-actin) | Sigma | 95906 | Concentration: 1 / 50 IT injected |
Rabbit anti-MCM5 | gift from Soojin Ryu, Heidelberg | Concentration: 1 / 500 | |
Stamping Ink 4K | Pelikan | 1 4k 351 197 | Concentration: 1 / 1 |
ISH probe primers | |||
Cystatin | gene number: ENSDARG00000074425 fw primer: GATTCACTGTCGGGTTTGGG Rev primer: ATTGGGTCCATGGTGACCTC |