Denna metod bygger på en injektion av 0,5 − 3 μL lösning i bröst korgen hos vuxna Zebrafiskar. Förfarandet levererar effektivt proteiner och kemiska föreningar i närheten av zebra fiskar hjärta utan att skada orgeln. Metoden är lämplig för att testa effekter av exogena faktorer på olika vävnader i hjärtat.
Den vuxna zebra fiskar hjärta ger en kraftfull modell i hjärt förnyelse forskning. Även om styrkan i detta system är baserad på transgena metoder, en snabb leverans av exogena faktorer ger en kompletterande teknik i funktionella studier. Här presenterar vi en metod som förlitar sig på administrering av några mikroliter lösning i perikardiell hålighet utan att orsaka hjärt infarkt skador. Intrathoracic (IT) injektioner kan effektivt leverera proteiner och kemiska föreningar direkt på hjärtats yta. De injicerade ämnena sprider sig genom epikardium till de underliggande kardiella vävnaderna. Jämfört med intraperitoneal (IP) injektioner, den största fördelen med intrathorakal injektioner är den fokus administrationen av de testade faktorerna på mål organet. Leveransen av molekyler direkt in i hjärtsäcken är en lämplig strategi för studier av hjärt prekonditionering och förnyelse hos vuxna zebra fiskar.
Bland ryggradsdjur äger zebra fisken en anmärknings värd förmåga att regenerera sina hjärtan1,2. Denna förmåga har rapporter ATS i flera skade modeller, nämligen ventrikulär Apex resektion, krysskada (CI) och genetisk återskapande ablation3,4,5,6,7. Efter invasiva skador, den skadade väggen i ventrikeln blir transitivt läkt av fibrotiska vävnad, som successivt ersätts av en ny hjärt muskeln8,9,10,11. Den tidiga sårläkning svar innebär kardium aktivering och rekrytering av immun celler12,13,14,15. Samtidigt blir cardiomyocyter nära den skadade hjärt muskeln aktive rad, dedifferentiera, förökar sig och successivt ersätta det sårade området inom 30 − 90 dagar16,17,18, 19. avsevärda framsteg när det gäller att dechiffrera de molekyl ära och cellulära mekanismerna för hjärtats förnyelse har uppnåtts tack vare till gången på genetiska verktyg, såsom cell-Lineage tracing analys, inducerbara gen överuttryck, linjer för fluorescerande vävnads reporter och crispr/Cas9 Gene mutesis20,21.
Vi har nyligen etablerat en modell av hjärt prekonditionering i den vuxna zebra fiskar av thorakotomi22,23. Prekonditionering ökar uttryck för hjärt skyddande gener och höjer återinträdein i cell cykeln i intakt och regenererande hjärtan. Dessa processer är förknippade med rekrytering av immun celler och Matrix remodeling22,24. Mekanismerna för prekonditionering är dåligt förstådda, och inrättandet av nya tekniker krävs för att främja detta forsknings område. I synnerhet, optimerad administrering av utsöndras signalering proteiner eller andra kemiska föreningar är viktigt att ytterligare undersöka detta ämne.
Att vara vatten levande djur, zebra fiskar kan naturligt absorbera olika ämnen upplösta i vatten genom sina gälar och hud. Detta ger en möjlighet för icke-invasiva läkemedel leverans genom nedsänkning av fisk i lösningar med olika kemikalier, såsom farmakologiska hämmare, Steroidhormoner, tamoxifen, BrdU och antibiotika. Många studier från olika laboratorier, inklusive vår25,26,27, har faktiskt utnyttjat denna metod, som är särskilt värdefull inom området regenerativ biologi6, 28. detta tillvägagångs sätt är dock inte lämpligt för tillförsel av PEPTIDER, DNA, RNA, morfolinos eller molekyler med begränsad vävnads permeabilitet. I dessa fall, en effektivare leverans uppnås genom mikroinjektion i kroppen, till exempel genom att sätta in kapillär i retro-orbital venös sinus, i intraperitoneal eller intraperikardiell hålighet29,30, och 31. Här beskriver vi ett förfarande för intrathoraxinjektion av en liten mängd lösning, som en lämplig metod för att studera hjärt förnyelse och prekonditionering hos vuxna Zebrafish.
Här beskriver vi en metod för att leverera exogena föreningar och proteiner in i perikardiell hålighet för att studera deras effekter på hjärtat hos vuxna Zebrafish. Proceduren är baserad på intrathoraxinjektion, vilket resulterar i leveransen av en liten mängd lösning i närheten av orgeln. Denna teknik utvecklades och beskrevs för att studera hjärt prekonditionering och förnyelse.
Det kritiska steget i detta förfarande är inträngning av glaset kapillär i bröst hålan. Detta steg beror på tre parametrar som är: styvhet och skärpa kapillärspetsen, vinkeln på penetration, och punkteringsstället. För att optimera penetrationen genom huden, bör den dragna delen av kapillär inte vara för lång, eftersom sådana nålar är för flexibla och böja i kontakt med huden. För att undvika detta kan stelheten anpassas genom att minska spets storleken med iridektomi saxen. Även om vinkeln för penetration kan variera mellan 30 ° och 45 °, kan den anpassas till styvheten i spetsen. I själva verket kommer en tunn spets tränga igenom huden bättre med en smalare vinkel.
För att optimera nålen penetration, insättnings stället bör vara omedelbart ovanför hjärt slagen. Risken för hjärtpunktion är vanligt vis låg mellan 5% och 8%. Införandet av nålen posteriort om hjärtat ökar risken för hjärtpunktion, som ses av ökad blödning. I sådana fall bör djuren avlägsnas från experimenten.
En annan källa till problem under IT-injektionen sker på kapillärnivå. I själva verket kapillär kan bryta när laterala krafter utövas på den. För att undvika detta måste nålen röra sig längs injektions axeln på ett rakt sätt. Ibland kan kapillär blockeras av vävnad rester som hindrar vätskan från att flöda. Nålen kan avblockeras genom att försiktigt dra ut spetsen medan du injicerar. Om detta inte förbättrar flödet, rekommenderar vi helt dra tillbaka nålen från bröst korgen och ersätta nålen.
Lesioner kan orsakas av en alltför djupt insatt nål i hjärtsäcken. För att undvika skador i hjärtsäcken får nålen inte sättas in för mycket (1 − 2 mm) i bröst korgen. Vissa läckor observerades när injektions volymen var större än 8 μL.
I Zebrafish är den exakta sammansättningen av den perikardiella vätskan okänd. Volymen av perikardiell hålighet uppskattas dock till ~ 10 μL31. Med tanke på att volymen av den vuxna zebra fiskar ventrikeln är cirka 1 − 2 mm3, vi antar att perikardiell kaviteten därmed har en liten volym, som måste övervägas före injektioner. Från våra preliminära studier har vi fastställt att det optimala intervallet för den injicerade volymen är mellan 0,5 och 3 μL för fisk som mäter 2,5 − 2,8 cm (avstånd från nos till kaudala stjälk). Denna volym kan anpassas beroende på storleken på fisken. Injektion av upp till 5 μL inducerade inte någon lesion i fisken av denna storlek. Emellertid, volymer från 8 μL var tillräckliga för att orsaka utbuktning och inre blödning som visas i figur 1F. Baserat på dessa data uppskattar vi att en mängd lösning som är större än 3 μL kan orsaka fysisk och fysiologisk påfrestning på orgeln. Denna begränsning kräver att välja en högre koncentration av molekyler i stället för att öka mängden av den injicerade lösningen.
En annan viktig faktor är den osmotiska egenskapen hos den injicerade lösningen, som bör vara i det fysiologiska intervallet. I själva verket, för att undvika en risk för osmotisk stress, rekommenderar vi HBSS som injektion medium.
I Zebrafish, de gemensamma metoder som används för att leverera droger är genom vattenrening och intraperitoneal injektion30,35. Även om båda dessa tekniker är lämpliga för många tillämpningar, IT-injektioner ger experimentella och ekonomiska fördelar, genom att minska riskerna för oönskade systemiska biverkningar och minska användningen av kostsamma molekyler, respektive. Denna metod kan vara lämplig för leverans av tamoxifen för att aktivera CRE-ERT2 transgena system som används för cell Lineage tracing analys, och vägleda modifierade RNAs för funktionella studier i regenereringsforskning.
IT-injektionmetoden i zebra fisk har tidigare beskrivits31,36. I dessa rapporter, intrathorakal injektioner utfördes med insulin nål, punktuell från den främre sidan. Däremot presenterar vårt protokoll en alternativ strategi med den dragna glas kapillär infogas från bakre riktningen. Specifikt tar vår strategi hänsyn till anatomin av fiskperikardium för att optimera injektionen med en minskad risk för hjärtpunktion. Dessutom, under förfarandet, fisken inte innehas av metalliska pincett, utan av en fuktig och mjuk svamp, som är en mer lämplig metod för att undvika någon yttre skada av fisken. Sålunda, den presenterade metoden kan vara bättre lämpad för studier av hjärthomeostas, prekonditionering och förnyelse hos vuxna Zebrafish.
IT-injektioner har redan fastställts i däggdjurs modellorganismer. Denna metod har faktiskt också tillämpats i experiment med svin och kliniska studier på människa37,38. Hos möss, transthorakala intramyokardiella injektioner styrs av ultraljud har använts för att utmana deras hjärta39. Inom denna artikel föreslår vi ett detaljerat protokoll för att under lätta användningen av IT-injektion för Zebrafish. Detta kommer att vara särskilt värdefullt för området, för att komplettera genetiska metoder i hjärthomeostas, prekonditionering och förnyelse forskning.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar V. Zimmermann för utmärkt tekniskt stöd och för fisk vård, D. König (universitetet i Fribourg) för kritisk läsning av manuskriptet, D. Kressler (University of Fribourg) för hjälp med zCNTF protein syntes, F. Ruggiero (Institut de Génomique Fonctionnelle de Lyon) för att ge ColXII anti kropp, och P. Martin (University of Bristol) för L-plastin anti kropp. Vi tackar Imaging Core Facility och proteomik plattform vid universitetet i Fribourg. Detta arbete stöddes av Swiss National Science Foundation, Grant nummer 310030_179213, och av Schweizerische Herzstiftung (Swiss Heart Foundation).
Hanks Balanced Salt Solution | Gibco by Life technology | 14065-056 | |
Iridectomy scissor | Roboz Surgical Instruments Co | RS-5602 | |
Macroscope (binocular) | M400 | with Apozoom | |
Micro-injector femtojet | Eppendorf | 5247 0034 77 | |
Microloaders femtotips | Eppendorf | 5242 956.003 | |
Micropipette glass needles type C | WPI | TW100F-6 | thin-wall capillary |
Micropipette puller model P-87 | Flaming/Brown | 20081016 | filament box 2.5 x 4.5 mm |
Sponge | any | any | dim. carved sponge 7cm x 3 cm x 1 cm |
Tricaine (Anestethic) | Sigma | E10521 | |
Dyes and Antibodies | Company | Catalog number | Comments |
anti-Chicken Cy5 | Jackson ImmunoResearch Laboratories | Concentration: 1 / 500 | |
anti-Guinea pig Cy5 | Jackson ImmunoResearch Laboratories | Concentration: 1 / 500 | |
anti-Rabbit Cy5 | Jackson ImmunoResearch Laboratories | Concentration: 1 / 500 | |
Chicken l-plastin | gift from P. Martin, Bristol | Concentration: 1 / 1000 | |
DAPI | Sigma | 10236276001 | Concentration: 1 / 2000 (1µg/ml); 1/100 IT injected |
Guinea pig anti-ColXII | gift from Florence Ruggerio, Lyon | Concentration: 1 / 500 | |
Phalloidin-Atto-565 (F-actin) | Sigma | 94072 | Concentration: 1 / 500 |
Phalloidin-Atto-647 (F-actin) | Sigma | 95906 | Concentration: 1 / 50 IT injected |
Rabbit anti-MCM5 | gift from Soojin Ryu, Heidelberg | Concentration: 1 / 500 | |
Stamping Ink 4K | Pelikan | 1 4k 351 197 | Concentration: 1 / 1 |
ISH probe primers | |||
Cystatin | gene number: ENSDARG00000074425 fw primer: GATTCACTGTCGGGTTTGGG Rev primer: ATTGGGTCCATGGTGACCTC |